一種sars相關冠狀病毒的靈長類動物模型及其構建方法和用途的製作方法

2023-05-21 13:33:01 4

專利名稱：一種sars相關冠狀病毒的靈長類動物模型及其構建方法和用途的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種SARS相關冠狀病毒的靈長類動物模型，尤其是恆河猴及食蟹猴動物模型，其構建方法以及用途。
背景技術：
重症急性呼吸症候群(Severe Acute Respiratory Syndrome，SARS)的廣泛流行嚴重威脅著人類的健康。國內外研究表明，SARS病原是一種變異的冠狀病毒，長為29742bp的正單鏈RNA病毒，其RNA和RNA之間重組率非常高。
雖然目前我國對SARS病原、診斷、來源等方面的研究均已取得一定進展，但尚缺乏合適的SARS感染動物模型，尤其是靈長類動物模型。因此，缺乏SARS動物模型已經成為限制預防和/或治療SARS藥物篩選、疫苗評價和發病機制等的研究瓶頸問題。
雖然，已知建立了眾多針對不同病原體的靈長類動物感染模型，但是針對造成SARS的冠狀病毒變異株建立靈長類動物感染模型而言，在動物品種、健康狀態的選擇、感染病毒的處理、劑量、途徑以及感染後的病毒檢測、免疫血清學確定等環節存在大量技術問題亟待解決。國外僅有一篇關於SARS冠狀病毒感染食蟹猴的信件短報(Nature，Vol.423，15MAY2003)，其中沒有披露具體的構建方法，所得動物感染模型的效果也不甚清楚。
本發明人有效的克服了現有諸多技術問題，成功的構建了中國恆河猴及食蟹猴SARS相關冠狀病毒感染模型。在所述動物中感染的重複性、穩定性好，為進一步研究該病毒的病原特性、發病機理、藥物篩選、疫苗評價等方面的研究奠定了重要基礎。

發明內容
本發明的一個方面涉及一種SARS相關冠狀病毒靈長類動物感染模型，尤其是SARS相關冠狀病毒中國恆河猴及食蟹猴感染模型。
恆河猴與食蟹猴感染SARS相關冠狀病毒後，均表現一度體溫生高，產生抗SARS相關冠狀病毒抗體IgM和IgG，體液分離病毒陽性，RT-PCR檢測病毒陽性可達感染後20天，此模型的建立，在病毒學及免疫學指標上，對SARS相關冠狀病毒的包括病原學、免疫學、發病機理的研究，以及藥物篩選、疫苗評價等應用方面有著不可替代作用，在SARS相關冠狀病毒選擇敏感感染動物研究方面有代表性的意義。
本發明的另一方面，涉及一種構建SARS相關冠狀病毒中國恆河猴及食蟹猴感染模型的方法。
在本發明的一個具體實施方案中，對待感染的中國恆河猴及食蟹猴採用經鼻腔滴鼻接種的方式，病毒接種量為0.5-1ml107半數組織細胞病變劑量(TCID50)。在本發明的又一實施方案中，對待感染的中國恆河猴及食蟹猴採用經氣管內注射病毒的接種方式，病毒接種量為0.5-1ml106TCID50。在本發明的又一實施方案中，對待感染的中國恆河猴及食蟹猴採用靜脈注射病毒的方式，接種量為0.5-1ml105TCID50。事實上，也可以選擇上述三種接種病毒方式的任意組合對所述動物進行接種。
由上述方法感染的本發明所述動物在接種後第3-5天出現發熱，第5天後RT-PCR檢測病毒基因陽性，可持續到20天，期間病毒分離陽性。
SARS感染人的途徑為接觸性感染和氣溶膠方式感染，主要以高熱和肺部感染症狀為主。本實驗方法首先通過呼吸道感染，包括滴鼻，氣管內注入病毒培養液，也通過靜脈注射感染，發現通過靜脈注射感染病毒量較少也能成功感染兩種猴，同時以同樣方法感染絨猴，未獲成功。表明非人靈長類對SARS相關冠狀病毒敏感性不同。
本發明的又一方面，涉及SARS相關冠狀病毒中國恆河猴及食蟹猴感染模型用於SARS相關冠狀病毒體內感染過程、發病機理、機體抵抗作用研究的用途。
SARS疾病目前留有許多問題未能解決，包括感染的靶器官、靶組織和靶細胞，對免疫系統的攻擊，免疫系統細胞的反應等，在人體內無法取材，而在模型猴中可開展時間動力學任何指標的取材、示蹤以及相關條件病原協同致病的研究中的用途。
本發明的又一方面，涉及SARS相關冠狀病毒中國恆河猴及食蟹猴感染模型用於抗SARS相關冠狀病毒藥物篩選和疫苗評價中的用途。
恆河猴與食蟹猴感染SARS相關冠狀病毒後，均能檢測到病毒學和免疫學指標，如在一定時間內產生抗SARS相關冠狀病毒IgM和IgG抗體，體液和組織內成功分離病毒，感染後20天內RT-PCR檢測病毒陽性，這些病毒學及免疫學指標，對SARS相關冠狀病毒藥物篩選、疫苗評價等應用方面有著不可替代作用。具體地，所述動物模型能夠用於如任何抗SARS病毒藥物，包括中藥的效果評價中。如果待測藥物具有抗SARS相關冠狀病毒的作用，則所述藥物的效果能通過猴體內改變以上指標而評價藥效以及毒副作用。
在我國現有實驗動物中沒有其他動物比實驗用猴更接近人類，因而，對疫苗的評價，這種模型具有無可替代的優越性。


圖1.恆河猴標本中SARS冠狀病毒RNA的套式RT-PCR檢測，其中泳道自左向右分別為1#883接種病毒第5天咽拭子；2#900接種病毒第5天咽拭子；3DL2000分子量標誌(2000，1000，750，500，250，100bp)；4陰性對照；5陽性對照。
圖2.恆河猴#883的肺臟活檢組織切片，其中上圖為獲自本發明動物模型的肺臟活檢組織切片，下圖為正常肺臟活檢組織切片對照。
實施例實施例1SARS病毒毒株的製備SARS毒種由中國疾病預防控制中心病毒病預防控制所提供，其分離自SARS病人，在Vero-E6細胞上培養傳代，經RT-PCR和電鏡形態觀察確定為SARS冠狀病毒，所述病毒已經根據國際承認用於專利程序的微生物保藏布達佩斯條約於2003年6月26日保藏在國際保藏單位中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，並給予了保藏號為0962，該國際保藏單位的地址是中國北京市海澱區中關村北一條13號。病毒TCID50為106pfu/ml。
實施例2動物模型的建立1.病毒接種選擇13月齡雌性和雄性中國恆河猴各一隻，編號為#900和#883，接種前按實驗用猴國家標準微生物SPF級進行復檢，並檢查SARS病毒抗體。經鼻腔接種實施例1所獲得的SARS病毒，病毒接種量為#900猴106TCID50(1ml體積)，#883猴105TCID50(1ml體積)。所有動物實驗均按《實驗動物所實驗動物使用及實驗規程》在SARS專用P3動物實驗室中進行。
2.接種後動物相關臨床症狀表現兩隻恆河猴在如前述劑量的病毒接種的第2～3天時，有一過性的體溫升高，39℃左右，隨後恢復到38℃左右。白細胞亦未見異常改變。無咳嗽、流涕、嘔吐、皮疹、腹瀉、氣促、呼吸困難、明顯食欲不振等臨床表現。
3.接種後動物樣本病毒監測在SARS冠狀病毒接種恆河猴1天後，每天收集咽拭子、鼻拭子和糞便標本，接種Vero細胞，進行病毒分離，每日觀察細胞病變，持續觀察10天後盲傳，具體方法參見[黃禎祥，田鵬，李玉英。病毒的組織培養技術。見黃禎祥主編。醫學病毒學基礎及實驗技術。北京科學出版社，1990，130-141]。結果表明持續觀察10天後未見細胞病理改變(CPE)出現，盲傳2代後，仍未見CPE，盲傳3代後，出現細胞病變。
4.動物模型中SARS冠狀病毒RNA的檢測在SARS冠狀病毒接種恆河猴1天後，每天收集咽拭子、鼻拭子和糞便標本，用QIAamp Viral RNA Mini Kit(德國Qiagen公司)，在P3實驗室內提取病毒RNA，用對應於SARS冠狀病毒1b區的引物進行套式RT-PCR檢測。引物序列為外側引物1#5』-GCTGCATTGGTTTGTTATATCGTTATGC-3』(SEQ ID NO1)，2#5』ATACAGAATACATAGATTGCTGTTATCC3』(SEQ IDNO2)；內側引物3#5』-TCACTTGCTTCCGTTGAGGTAGCCAGCGTGGTGGTTCATACAA-3』(SEQ ID NO3)，4#5』-GGTTTCGGATGTTACAGCGTCTCCCGGCAGAAAGCTGTAAG CT-3』(SEQ ID NO4)。
使用One Step RT-PCR試劑盒(TAKALA公司產品)進行第一輪RT-PCR反應，具體反應條件參見文獻[陶生策，楊仁全，李澤等。SARS冠狀病毒基因晶片的製作與初步臨床樣本驗證。清華大學學報(自然科學版)，2003，43715-720]，目的PCR產物長度為797bp。兩輪PCR反應結束後取5μl產物行2％瓊脂糖凝膠電泳，結果參見附圖1。
電泳結果顯示針對提取自恆河猴咽拭子、鼻拭子和糞便標本中的SARS病毒冠狀病毒RNA，以細胞培養冠狀病毒為陽性對照，以正常恆河猴咽拭子為陰性對照，進行上述套式RT-PCR檢測，發現在病毒接種第5天可從咽拭子中檢測到大小為797bp的目的條帶，說明這些標本中存在冠狀病毒。
上述結果證實本發明採用SARS冠狀病毒鼻腔接種能有效感染恆河猴，所述病毒在該動物模型中可能有複製和排毒。
5.動物模型的病理學檢測在動物接受病毒接種的第7天，用BADD組織活檢槍取肺組織，10％福馬林固定，石蠟包埋，常規病理組織切片處理後，H-E染色、鏡檢。
兩隻恆河猴的肺臟活檢組織病理學觀察結果顯示，肺組織均存在不同程度的肺泡間隔增寬、上皮增生、毛細血管擴張充血和淋巴細胞浸潤，並且可見散在分布的巨噬細胞等間質性肺炎表現(參見圖2A，圖2B為正常對照肺組織)。由此證實，採用本發明方法構建的動物模型，能夠有效模擬SARS病毒在靈長類動物中的感染過程。
6.動物模型中SARS病毒相關抗體的血清學檢測在SARS冠狀病毒接種後第5、9、13、17和20天，經靜脈採血1ml分離血清，-80℃下保存備用。血清SARS冠狀病毒特異性抗體(IgG、IgM)檢測採用「SARS冠狀病毒抗體診斷試劑盒(酶聯免疫法)IgG、IgM」(北京華大吉比愛生物技術有限公司)。具體操作按說明書進行。
結果顯示病毒接種第5天，#900猴和#883猴抗SARS冠狀病毒IgM陽性；病毒接種第17、20、24、28、32天，#900猴和#883猴血清抗SARS冠狀病毒IgG抗體陽性。
討論本發明人率先用從我國SARS病人標本中分離的SARS冠狀病毒實驗接種中國恆河猴，病毒攻擊5天後，套式RT-PCR可從猴咽拭子中擴增出SARS冠狀病毒基因，肺組織活檢病理學觀察也見到肺間質性炎變，並且抗SARS病毒抗體陽轉，由此，成功的建立了一個SARS冠狀病毒感染的恆河猴模型，在所得動物模型中能夠有效實現病毒的體內複製。
同時所述恆河猴模型也出現了SARS感染樣病理改變，雖然並未出現持續高熱、咳嗽等，但恆河猴的白細胞計數無升高，此點表現與病人相似。
從實驗結果看，本發明所獲得的恆河猴模型在感染SARS冠狀病毒後能夠出現SARS感染樣病理學改變和排毒現象，其可用於SARS感染的發病機理研究、抗SARS病毒的藥物篩選、疫苗評價。
權利要求
1.一種SARS相關冠狀病毒靈長類動物感染模型。
2.權利要求1的動物感染模型，其為SARS相關冠狀病毒的中國恆河猴感染模型。
3.權利要求1的動物感染模型，其為SARS相關冠狀病毒食蟹猴感染模型。
4.權利要求2和3的動物感染模型，其中所述中國恆河猴和食蟹猴，經選自如下至少一種的接種方式接種後1)鼻腔滴鼻接種，病毒接種量為0.5-1ml 107TCID50；2)經氣管內注射病毒，接種量為0.5-1ml 106TCID50；和/或3)靜脈注射病毒接種量為0.5-1ml 105TCID50，在接種後第2-3天起表現出SARS樣感染症狀，第2-3天體溫升高，一定時間內產生抗SARS相關冠狀病毒IgM和IgG抗體，並可體液和組織內成功分離病毒，且感染後20天內RT-PCR檢測病毒陽性。
5.一種用於製備權利要求1的SARS相關冠狀病毒靈長類動物感染模型的冠狀病毒分離株，具有保藏號CGMCCC 0962。
6.一種構建權利要求1所述SARS相關冠狀病毒靈長類動物感染模型的方法，包括選自至少一種如下接種方式的步驟1)經鼻腔滴鼻接種，病毒接種量為0.5-1ml 107TCID50；2)氣管內注射病毒接種量為0.5-1ml 106TCID50；和/或3)靜脈注射病毒接種量為0.5-1ml 105TCID50；使得所述動物模型於接種後第2-3天體溫升高，一定時間內產生抗SARS相關冠狀病毒IgM和IgG抗體，體液和組織內成功分離病毒，感染後20天內RT-PCR檢測病毒陽性。
7.權利要求6所述的方法，其中還任選的包括1)動物模型建立中的病毒監測步驟2)動物模型建立中的血清抗體監測步驟；3)血清抗體中和實驗監測步驟；和/或4)組化病理學檢測步驟。
8.權利要求7所述的方法，其中所述血清抗體採用IFA方法和/或ELISA方法檢測。
9.權利要求1所述SARS相關冠狀病毒靈長類動物感染模型用於抗SARS相關冠狀病毒藥物篩選的用途。
10.權利要求1所述SARS相關冠狀病毒靈長類動物感染模型用於抗SARS相關冠狀病毒的疫苗評價中的用途。
全文摘要
本發明涉及一種SARS相關冠狀病毒的靈長類動物模型，尤其是恆河猴及食蟹猴動物模型，其構建方法以及用途。
文檔編號G01N33/569GK1566947SQ0314897
公開日2005年1月19日 申請日期2003年6月27日 優先權日2003年6月27日
發明者秦川, 魏強, 蔣虹, 朱華, 高虹, 塗新明 申請人:中國醫學科學院實驗動物研究所