細胞的血小板靶向微流體分離的製作方法

2023-05-19 06:40:41

本申請要求2014年8月7日提交的美國臨時申請序列號62/034,522的優先權，其全部內容通過引用併入本申請。

關於聯邦資助研究的聲明

本發明是在美國國立衛生研究院提供的編號為5-U01-EB012493-04和EB002503-06A1，以及美國癌症協會提供的編號為125929-PF-14-137-01-CCE的政府資助下進行的。政府對本發明享有一定的權利。

技術領域

本發明涉及從流體如血液分離有核細胞。

背景技術：

腫瘤細胞從原發部位向遠端器官的轉移、擴散和生長代表了癌症最具破壞性和致死性的屬性，並且是90％癌症死亡的原因。雖然尚未建立對轉移生物學的系統理解，但是越來越多地認識到循環腫瘤細胞(CTC)作為轉移起始細胞的重要性，其將為癌症進展的早期診斷、表徵和監測提供潛在的便捷來源。然而，從癌症患者的血液中可靠地檢測和非侵入性分離CTC和其他有核細胞仍然在技術上具有挑戰，這不僅是因為它們極其稀有地存在(低至在十億或更多的血細胞中存在一個)，而且也是由於生物物理和生物化學性質的異質性水平。

就尺寸而言，CTC和其他稀有有核細胞可以小至5微米至8微米，例如紅細胞的尺寸，或8微米至18微米，其與人白細胞大致具有相同尺寸，或者在CTC簇形式中大於100微米。就表面化學而言，已廣泛用於在通常情況下在陽性選擇方法中靶向CTC和上皮細胞的生物標記物上皮細胞粘附分子(EpCAM)的表達在臨床樣品之間已顯示出較大差異，並且作為上皮-間質轉化(EMT)的結果其還會隨著癌症進展而顯著下調。而且，已報導了腫瘤細胞在轉移發展期間與微環境中的宿主細胞(例如血液細胞，如白細胞和血小板)存在活躍的相互作用，這可能使得CTC的檢測和分離更具挑戰性。

發明概述

本公開描述了使用與血小板特異性結合的結合部分從樣品流體，例如生物流體，如血液、骨髓、胸腔積液和腹水中分離血小板相關的有核靶細胞，如循環上皮細胞、循環腫瘤細胞(CTC)、循環內皮細胞(CEC)、循環幹細胞(CSC)、中性粒細胞和巨噬細胞的方法和系統。該方法包括在使得結合部分與樣品中的任何靶細胞例如CTC，例如包覆血小板的CTC結合的條件下使包含血小板相關靶細胞例如CTC的樣品流體流過某室例如細胞捕獲室以形成複合物；然後從這些複合物中分離和收集靶細胞，從而從樣品流體中分離靶細胞。

在某些實施方式中，使用設計為實現血小板靶向靶細胞捕獲的系統例如一階段或二階段微流體系統實施該方法。在一些實施方式中，在使樣品流體通過細胞捕獲室之前，可以首先使用微流體減積(debulking)裝置處理流體例如血液樣品以除去游離的、未結合的血小板和紅細胞(RBC)。減積裝置可以包括一個或多個微柱陣列以實現基於流體動力學尺寸的分選。然後可以使用使用抗血小板抗體官能化的細胞捕獲室處理所得到的含有靶細胞和白細胞(WBC)的樣品流體以高通量捕獲血小板相關的靶細胞如CTC。在一些實施方式中，細胞捕獲室可以包括能夠增強樣品流體中的任意血小板相關靶細胞與血小板抗體相互作用的混合結構。在一些實施方式中，此類混合結構以稱為「人字形」微混合器的結構呈現。

在通常情況下，本公開涉及從如本申請所述的樣品流體中分離血小板相關的有核靶細胞例如循環上皮細胞、CTC、CEC、CSC、中性粒細胞和巨噬細胞的方法。該方法包括獲得細胞捕獲室，該細胞捕獲室含有結合至室的一個或多個壁的多個結合部分，其中該結合部分與血小板特異性結合；在使結合部分與樣品中的任意血小板相關的有核靶細胞結合的條件下使樣品流體流過細胞捕獲室以形成複合物；以及從複合物分離和收集血小板相關的有核靶細胞，從而從樣品流體分離靶細胞。

在一些實施方式中，本申請所述的方法還可以包括在使樣品流體流過細胞捕獲室之前使用血小板抑制劑處理樣品流體，其中血小板抑制劑抑制來自粘附於其他細胞的未結合的血小板。例如，其他細胞可以是血小板、紅細胞和/或白細胞。在不同的實施方式中，血小板抑制劑可以是茶鹼、腺苷、雙嘧達莫、阿加曲班或前列腺素I2。

在本申請所述的任意實施方式中，結合部分可以是與血小板特異性結合的抗體。

在一些實施方式中，該方法還可以包括在使樣品流體流過細胞捕獲室之前，選擇性地除去來自樣品流體的未結合血小板，同時保持樣品流體中的血小板相關的有核靶細胞。例如，可以在包含含有微柱陣列的通道以執行確定性側向位移的微流體裝置中進行血小板消除。例如，微柱可以排布成多行，其中微柱在行內間隔開約30微米至約60微米的距離，例如約35微米至約56微米，隨後的行與前一行間隔開約5微米至約15微米的距離，例如約5.6微米至約9.0微米，並且其中在每個隨後的行中的微柱與在前一行中的微柱之間橫向偏移的距離小於微柱在行內的間隔。

在其他實施方式中，在微流體裝置中使用離心力或慣性力或者這兩者或者通過密度梯度離心進行血小板消除。

在一些實施方式中，細胞捕獲室和微流體裝置可以均位於單一基底上或者其可以位於分離的基底上並且經由導管流體連接。在一些實施方式中，細胞捕獲室包含在其內表面上排布的多個人字形結構以便在樣品流體內產生微渦流。

在設計用於選擇性除去靶細胞的一些實施方式中，結合部分結合至包含結合對的第一構件的納米結構，其中細胞捕獲室的一個或多個內表面結合至使用結合對的多個第二構件官能化的明膠層，且其中納米結構通過結合對的第一和第二構件的結合相互作用結合至明膠的頂層。在這些方法的一些實施方式中，血小板相關的有核靶細胞通過結合部分結合至納米結構，並且通過在升高的溫度下熔化明膠從明膠釋放納米結構分離血小板相關的有核靶細胞。或者，可以通過對明膠層施加局部剪切應力或者通過使用光靶向光熱效應從明膠釋放納米結構分離靶細胞。

在另一個方面，本公開涉及從樣品流體中分離血小板相關的有核靶細胞如CTC的系統，例如兩階段微流體系統。這些系統包括第一室、第二室以及將兩個室流體連接的導管。特別地，導管將第一室產物出口與第二室入口流體連接。

在這些系統中，第一室包括具有入口、廢物出口、產物出口的微通道，和排布在入口和出口之間的微柱陣列，其中微柱排布成行並間隔開一定距離，該距離使得紅細胞和未結合的血小板能夠流過裝置到達廢物出口並引起血小板相關的有核靶細胞被微柱陣列橫向位移至產物出口，其中在每個隨後的行中的微柱與在前一行中的微柱之間橫向偏移的距離小於微柱在行內的間隔。

第二室包括具有入口和出口的微通道，其中流體通過微通道從入口流動到出口，以及界定於其中和排布在微通道的一個或多個壁、底板和頂板的內表面上的多個凹槽以便在所述樣品流體內產生微渦流；以及固定到至少一個內表面的結合部分，其中結合部分與血小板特異性結合。例如，結合部分可以是與血小板特異性結合的抗體。

在這些系統的不同實施方式中，微柱在行內間隔開約30微米至約60微米的距離，例如約35微米至約56微米，且隨後的行與前一行間隔開約5微米至約15微米的距離，例如約5.6微米至約9.0微米。在不同的實施方式中，第一室和第二室均位於單一基底上或者其可以位於分離的基底上並且經由導管流體連接。

在一些實施方式中，在第二室中的凹槽包括尖端和與尖端連接以形成V形的兩個臂，並且凹槽被排布成使得樣品流體從臂流向尖端。

在這些系統的某些實施方式中，結合部分結合至包含結合對的第一構件的納米結構，其中第二室的一個或多個內表面結合至使用結合對的多個第二構件官能化的明膠層，且其中納米結構通過結合對的第一和第二構件的結合相互作用結合至明膠的頂層。

如在本申請中使用的，術語「結合部分」指能夠粘附至靶點如顆粒、分子或細胞的任意分子或試劑。結合部分包括例如配體結合對、抗體、適體或核酸分子成員。一些結合部分特異性結合至靶分子或試劑，如在細胞表面上的受體或細胞表面標記物，以及一些非特異性結合至可以共享共同特徵的多個靶點。

如在本申請中使用的，術語「特異性結合」指結合部分在包含其他顆粒或分子的樣品中選擇性和優選結合至特定靶點如顆粒、分子或細胞，例如結合至細胞表面上的分子。

與依賴於癌細胞特殊生物物理和/或生物化學性質的現有CTC分選技術相比，本申請所述的方法和系統著眼於癌症轉移過程中活躍的細胞間相互作用，其不受規模、癌症類型或腫瘤表面抗原表達水平的限制。更重要的是，這種新方法和系統能夠分離非常特殊的有核靶細胞亞群如CTC，其與較高的轉移可能性相關，但是難以由其他技術靶向，並且因此其為早期癌症診斷和更好了解癌症是如何擴散的提供了有價值的信息。

特別地，本申請所述新方法和系統的一個益處是其不依賴於靶細胞表面上的特異性生物標記物。很多目前的技術依賴於上皮細胞粘附分子(EpCAM)的表達，這是一種在陽性選擇方法中廣泛使用的靶向上皮細胞和CTC的生物標記物。然而，EpCAM的表達在臨床樣本之間的差異較大並且作為上皮-間質轉化(EMT)的結果其還會隨著癌症進展而顯著下調。本發明方法和系統克服了現有方法存在的這個困難。

除非另有定義，否則本申請中使用的所有技術和科學術語具有與本發明所屬領域普通技術人員的通常理解具有相同含義。儘管可以將與本申請中描述的那些相似或等同的方法和材料用於本發明的實施或測試中，但是適宜的方法和材料如下文所述。本申請中提及的所有出版物、專利申請、專利和其他參考文獻均通過引用整體併入。如有衝突，以本說明書及其所包括的定義為準。此外，材料、方法和實施例僅是示例性的並且並非旨在限制。本發明一個或多個實施方式的細節列於附圖和下述說明書中。本發明的其他特徵、目的和優點將是從說明書和附圖以及從權利要求中顯而易見的。

附圖說明

圖1A是經由血小板相關的CTC腫瘤轉移的示意圖。

圖1B是為實現血小板靶向CTC捕獲設計的兩階段微流體平臺一個實施方式的示意圖。

圖2A是減積晶片一個實施方式的示意圖。

圖2B是在減積晶片上的微柱陣列的一個實施方式的示意圖。

圖3是微渦流「人字形」晶片一個實施方式的示意圖。

圖4A至圖4D是顆粒例如細胞或細胞簇流過圖3所示的微渦流「人字形」晶片的流動模式的一系列示意圖。

圖5是顯示分別使用EpCAM和CD41抗體捕獲的來自轉移性肺癌患者血液樣品的CTC計數的圖。

圖6是顯示單個細胞、1或2個WBC簇以及2個以上WBC簇形式的CTC計數的圖。

圖7是顯示加入EDTA和前列腺素I2降低血小板-白細胞聚集形成的圖。

圖8A和圖8B是針對未經處理(8A)和經前列腺素I2處理(8B)血液樣品在微流體「人字形」晶片上捕獲的WBC的熱圖。

相同附圖標記在不同附圖中表示相同元件。

具體實施方式

如圖1A中所示意的，認為腫瘤細胞與血小板之間的相互作用在血源性轉移中發揮作用。最引人注目的證據是在幾個獨立的小鼠研究中發現的通過血小板消耗抑制轉移和通過血小板重建恢復轉移潛能。惡性腫瘤細胞在表面上激活和聚集血小板的獨特能力為腫瘤的成功轉移提供了很多優勢，該過程稱為腫瘤細胞誘導的血小板聚集(TCIPA)。血小板可能不僅有助於血管新生中的血管重塑過程，而且還可以通過使其逃避剪切力和免疫監視顯著增強腫瘤細胞在血液中的存活。

根據本申請所述的新方法和系統，可以將在血小板上的一大類粘附受體用於從樣品流體如血液例如全血中分離血小板相關的有核靶細胞，如上皮細胞、CTC、中性粒細胞和巨噬細胞。此外，最近關於血小板與腫瘤細胞之間信號傳導的研究揭示了來源於血小板的生長因子/細胞因子有助於誘導上皮-間質轉化(EMT)並進一步增強轉移潛能。因此，新方法和系統能夠分離具有增強的轉移潛能的CTC，並因而與同血小板無關的其他CTC相比其可能提供更好的診斷信息。

從樣品流體分離靶細胞-血小板簇的方法

本方法和系統利用了某些有核細胞例如CTC與血小板之間獨特的相互作用以及利用與此類靶細胞結合(例如結合至如包覆於靶細胞表面上)的血小板作為普遍存在的基於細胞的標記物靶向並從樣品流體如血液例如全血中分離這些靶細胞。

在通常情況下，新方法使用含有多個結合部分的室，結合部分結合至該室的一個或多個壁，其中結合部分與血小板特異性結合；在使結合部分與樣品中的任意血小板相關靶細胞結合的條件下使含有靶細胞(如有)的樣品流體流過該室以形成複合物；以及從複合物分離和收集靶細胞，從而從樣品流體分離靶細胞。而且，該方法還可以包括以下步驟：在使樣品流體流過該室之前從樣品流體中選擇性除去未結合的血小板和/或其他汙染細胞如紅細胞(RBC)同時在樣品流體中保持血小板相關的靶細胞和/或在該室中進行混合以增加血小板與結合部分之間的接觸。

由於TCIPA是源自腫瘤細胞與宿主微環境之間內在相互作用的一般現象，因而血小板靶向的方法具有不依賴於腫瘤膜表位檢測和分離血源性轉移中的廣譜有核靶細胞的潛力。

為減少WBC的汙染和增加CTC的純度，可以在檢測前向血樣中加入血小板抑制劑以穩定血液。可以使用多種血小板抑制劑如茶鹼、腺苷、雙嘧達莫、阿加曲班和前列腺素I2用於穩定血液。EDTA與前列腺素I2的組合在抑制血小板-白細胞聚集物(PLA)形成方面特別有效，其能夠使血樣中汙染WBC的數量減少90％。

與血小板相關靶細胞結合的結合部分

可以將多種結合部分用於結合樣品流體中的血小板。例如，多種已知靶向不同血小板表面受體的抗體，包括CD41和CD61(整合蛋白α2bβ3的亞基)；CD42b和CD42c(von Willibrand因子(γWF)的主要受體)；糖蛋白VI(GP VI)(膠原受體)；以及血小板生成素受體(TPO-R)。這些抗CD41抗體能夠有效地使用，因為其對血小板具有較高的捕獲效能和較低的非特異性結合。

可以使用多種方法如矽烷化學將結合部分官能化於固體支持物如PDMS或玻璃表面上。具有胺、醛或巰基端基的不同矽烷前體能夠與經氧等離子體處理的PDMS/玻璃表面交聯，可以將其進一步與不同結合部分綴合。在一個特定示例中，微流體通道形式的固體支持物經3-巰基丙基三甲氧基矽烷修飾，然後加入N-y-馬來醯亞胺丁醯氧基琥珀醯亞胺酯作為接頭，最後與NeutrAvidin(中性抗生物素蛋白)綴合。然後任何生物素化的結合部分如生物素化的血小板抗體能夠通過抗生物素蛋白-生物素化學容易地官能化於該裝置上。

使樣品流體流過具有結合部分的室

在表面官能化後，通常使用試劑封閉該裝置以避免非特異性結合，例如使用有效量的牛血清白蛋白(BSA)，例如3％BSA。隨後，使特定體積例如1至10mL，例如2、3、4、5或6mL樣品流體，例如血液，例如全血或血沉棕黃層流入該系統。通常在室溫條件下以設定壓力例如0.03至0.15psi，例如0.05、0.075或0.1psi以及1-5mL/小時，例如1、2、3或4mL/小時的流速處理樣品流體。

使樣品流體減積以除去未結合的血小板

由於全血中存在大量血小板(～105/μL)並且其具有使結合部分飽和的潛在作用，可以先對血樣進行處理以除去游離的、未結合的血小板。此外，除去一些或大部分紅細胞(RBC)是有利的。可以使用例如密度梯度離心或基於微流體的細胞分離實現減積。

密度梯度離心通常使用收集於CPT管中的血樣進行，該管中含有抗凝劑以及聚酯凝膠和密度梯度液體。離心後，然後通過從液體界面小心吸出收集有核的細胞，其中存在來自紅細胞和血小板的微量汙染。

可以使用本領域公知的不同設計和技術實現基於微流體的血液減積。例如，可以在彎曲的例如蛇形微流體通道中利用慣性力，以通過離心或慣性力(例如慣性聚焦)或者這兩者基於其尺寸的差別聚焦和分選細胞(參見例如美國專利號8,807,879)。此外，也可以利用疏水過濾和/或聲學駐波分選不同尺寸的細胞。

在另一個實施方式中，可以使用微流體減積裝置從樣品流體中除去未結合的血小板。此類裝置可以由一個或多個微柱陣列組成，以實現基於流體力學尺寸的分選，如下面進一步詳細描述的。在通常情況下，這些微流體減積裝置使用基於流體力學尺寸的分選以實現全血的低剪切微流體減積。將RBC、血小板和血漿蛋白棄去，但保留有核細胞(WBC和CTC)並將其呈遞至進行靶細胞例如CTC捕獲的第二階段。微流體減積的操作原理是基於依賴於流體力學尺寸的確定性橫向位移，其中含細胞和無細胞溶液同時流過微柱陣列導致了快速的基礎尺寸的分離(參見例如美國專利號8,986,966和美國專利號8,585,971)。亦參見，Ozkumur等，「Inertial Focusing for Tumor Antigen-Dependent and-Independent Sorting of Rare Circulating Tumor Cells,」Science Translational Medicine,5(179):179ra47(DOI:10.1126/scitranslmed.3005616)(2013)。

通過優化陣列配置(包括微柱之間的空隙或空間以及相鄰行之間的位移)和流速，能夠實現超過5-log的游離未結合血小板的消耗，同時保持大部分有核細胞。然後可以將含有有核靶細胞和白細胞(WBC)的流體產物直接導入如本申請所述的含有血小板特異性結合部分的室。

混合樣品流體以增強結合相互作用

為了增強樣品流體中任意血小板相關靶細胞與室中結合部分的相互作用，可以在室內包含混合結構。例如，包括鋸齒形、蛇形或扭曲通道的不同通道結構設計可用於被動混合。此外，還可以通過引入由聲學、壓力擾動或介電泳技術實現的主動微混合進一步增強混合性能。

一種有用的設計稱為「人字形」微混合器，其包括在使用血小板抗體官能化的用於高通量捕獲血小板相關的靶細胞如CTC的室的一個或多個內壁、底板或頂板上(參見例如，PCT申請號WO 2010/036912)。在通常情況下，將1-10mL樣品流體例如血沉棕色層或經減積的血液流入該系統。通常在0.03-0.15psi例如0.05、0.075或0.1psi下於室溫條件下以1至2mL/hr的流速使連續搖動的樣品流體通過該裝置。

處理在室中捕獲的靶細胞

可以對細胞捕獲裝置中捕獲的所有細胞進行處理以進行鑑定，例如使用染色測定，例如四色染色測定，以同時進行靶細胞鑑定和血小板表徵。將針對腫瘤標記物(例如EpCAM、細胞角蛋白、表皮生長因子受體(EGFR)、人表皮生長因子受體2(HER-2)、鈣粘蛋白-11以及4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI))為陽性的捕獲細胞，且任選地針對造血標記物(如CD45、CD14、CD16)也為陰性的那些評分為CTC。可以使用計數範圍從0.4至8.5個CTC/mL全血樣品的新方法實現可靠的CTC捕獲。可以使用其他標記物鑑定其他靶細胞。例如，可以使用CD24、CD133和CD326檢測上皮細胞；使用CD15、CD16和CD66b檢測中性粒細胞；以及使用CD11b、CD68和CD163檢測巨噬細胞。此外，可以使用CD34和CD146鑑定循環內皮細胞(CEC)以及使用CD44、CD90和ALDH1鑑定循環幹細胞(CSC)。

當使用現有技術如使用抗上皮標記物抗體如EpCAM抗體官能化的裝置將CTC捕獲於微流體裝置上時，結果顯示出一致的與本發明方法相比減少的陽性命中。參見圖5，其如下文實施例2中更加詳細討論的，顯示出本申請所述的細胞捕獲系統能夠可靠地捕獲來自具有上皮(肺、乳腺)或非上皮(黑色素瘤)腫瘤來源的轉移性癌症患者的單細胞或細胞簇形式的CTC。使用本血小板靶向方法具有更高的CTC計數部分地是由於該新方法能夠從肺和其他上皮腫瘤類型捕獲CTC，上述腫瘤類型可能失去其上皮性質並且因此變得更加難以使用抗上皮標記物抗體如EpCAM抗體靶向。

此前的EpCAM靶向方法通常產生有限地與血小板相關的CTC，而使用本申請所述的新方法捕獲的CTC顯示出寬範圍的血小板覆蓋，包括完全被血小板/纖維蛋白包覆的CTC的特殊亞群。已將這些血小板覆蓋的CTC假設為高轉移潛能前體，因為血小板增強了腫瘤細胞的存活和增殖，但是其很難通過靶向腫瘤表面抗原的常規陽性選擇方法捕獲。可以使用定量成像方法進一步研究CTC表型與血小板分布之間的相關性。結合我們小組最近開發的受控細胞釋放策略，也可能實現單細胞水平的基因型研究，這預期將進一步拓展我們在癌症轉移方面的知識。

一旦使用新方法捕獲了血小板相關的CTC，可以使用與肺癌樣品相同的方案鑑定乳腺癌CTC，而通過使用靶向黑色素瘤特異性抗原的抗體或抗體混合物染色鑑定黑色素瘤CTC(例如，抗CSPG4、MCAM、TYRP1和α-SMA抗體中的任意一種或多種)。

通過選擇性釋放純化所捕獲的靶細胞

在一些樣品流體如陳化全血中，可能存在大量血小板相關的WBC，其是使用新方法與血小板相關的靶細胞一起分離的。

在一些實施方式中，新方法可以包括選擇性釋放與含有結合部分的室結合的靶細胞如CTC的步驟。例如，如國際申請公開號WO 2014/121204中所描述的，細胞捕獲室可以包括與納米結構結合的結合部分，納米結構本身包括結合對的第一構件，其中該室的一個或多個內表面結合至使用多個結合對的第二構件官能化的明膠層，並且其中該納米結構通過結合對的第一和第二構件的結合相互作用結合至明膠的頂層。然後靶細胞(通過其相關的血小板結合至與納米結構結合的結合部分)可以通過兩種釋放機制中的一種從室中釋放。

在第一種釋放機制中，可以通過例如在升高的溫度下融化明膠將納米結構從明膠上釋放從細胞捕獲室分離和除去靶細胞如CTC。通過升高溫度，例如超過30℃，例如37℃，所捕獲的靶細胞可以以批量的方式釋放。或者，在第二種釋放機制中，通過對明膠層施加局部剪切力，可以使靶細胞從明膠上釋放。通過在明膠中增加局部剪切力，例如通過使用振動裝置施加控制頻率的力，例如在PCT WO 2014/121204中描述的微尖裝置，可以從細胞捕獲室選擇性釋放單細胞。

除了單個CTC(約55％)以外，新方法還分離血小板靶向平臺上不同尺寸的細胞簇。事實上，超過40％所捕獲的CTC是CTC/WBC簇形式。見圖6，其顯示了約30％的CTC與1或2個WBC成簇，以及約15％的CTC與2個以上WBC成簇。相互作用WBC的數量隨著CTC周圍的血小板覆蓋而增加。目前的方法靶向單一CTC和CTC/WBC簇的能力(後者非常難以通過常規的基於親和性的陽性或陰性選擇方法分離)將使得能夠通過非侵入性血液活檢對癌症轉移進行全面表徵，並且其還在下遊應用中開闢了新機會，如CTC培養，因為在特定微環境中會改善CTC的存活/增殖。

分離CTC/WBC的能力使得能夠分離在其他現有的CTC分離技術中會失去的細胞群。例如，陰性選擇CTC分離技術利用基於抗體的結合使用磁性材料靶向WBC。在這些方法中，將磁性材料官能化以使其與WBC特異性結合併且在進入微流體系統前將其引入流體樣品。然後流體樣品進入「偏轉通道」經受定向的磁性梯度以使得磁性顆粒以及與其結合的任意細胞沿一定方向偏轉。當將含有與一個或多個磁性顆粒結合的靶細胞/顆粒的流體樣品引入偏轉通道時，由附近磁體產生的磁力沿磁性梯度方向牽拉磁性顆粒(以及所附著的細胞/顆粒)。在陰性選擇CTC分離的情況下，這種分離將WBC以及附著於WBC的任意其他顆粒/細胞轉移至「廢物」通道，並分離「產物」通道中未結合的CTC。這種方法導致了與WBC結合的任意CTC的損失，其與磁性顆粒結合又進入了廢物通道。

本申請所述的兩階段微流體平臺不存在上述缺陷。

從樣品流體分離靶細胞的微流體系統

如上所述，用於從樣品流體分離血小板相關的有核靶細胞如CTC的方法使用細胞捕獲室，細胞捕獲室含有與該室的一個或多個壁、底板和/或頂板結合的多個結合部分，其中結合部分與血小板特異性結合。在使得結合部分與樣品中的任意血小板相關的靶細胞結合的條件下使含有靶細胞的流體樣品流過該室以形成複合物。該過程使得靶細胞如CTC從複合物中分離和收集，從而從樣品流體中分離靶細胞。而且，如圖1B中所示，該系統可以包括上遊部件(第一階段110)，其在使樣品流體流過細胞捕獲室(第二階段120)之前，從樣品流體中選擇性地除去未結合的血小板和其他細胞例如紅細胞(RBC)，同時保持樣品流體中的血小板相關的CTC。

如圖1B中所示，向該系統的輸入流體可以是全血130。第一階段110將未結合的血小板以及其他細胞例如RBC 140與有核細胞(150)分離，有核細胞(150)繼續通過該系統進入血小板靶向捕獲室(120)。

第一階段——從樣品流體除去紅細胞和血小板的減積裝置

對於第一階段而言，整個系統可以包括減積裝置200，例如由一個或多個微柱陣列組成的微流體裝置，以便通過基於流體力學尺寸的分選從全血中除去RBC和游離的血小板，其使得較小的血小板和RBC作為廢物離開該裝置，同時使得較大的WBC和CTC以及細胞簇進入第二階段，即細胞捕獲室。

如圖2A中所示，第一階段系統可以在單一晶片200上生產。在一些實施方式中，晶片可以包括入口202，一個或多個微柱陣列205(在本圖中是兩個)以及出口203。

如圖2B中所示，該系統中的第一階段可以是使用微柱陣列205分離細胞的流體力學分選裝置，微柱陣列205基於其尺寸、形狀或可變形性選擇性地使顆粒通過。微柱陣列中空間的尺寸、形狀或可變形性決定了能夠通過該陣列的細胞類型。可以將兩個或多個微柱陣列串聯或平行排布，例如以連續除去尺寸遞增的細胞。對於這種微流體系統的描述，參見例如美國專利號8,986,966、美國專利號8,585,971和Ozkumur等(2031)，如上所述。

在本申請所述的裝置中可以使用多種微柱210尺寸、幾何形狀和排布。可以使用不同形狀的微柱，例如具有圓形、正方形、矩形、橢圓形或三角形截面的微柱。可以對微柱之間空隙220的尺寸和微柱的形狀進行優化以確保迅速和有效的分離。例如，RBC的尺寸範圍為5-8μm量級，以及血小板的尺寸範圍為1-3μm量級。所有WBC的尺寸均大於10μm。考慮到這些尺寸，儘管使用更大的微柱之間的空隙能夠增加RBC和血小板通過陣列的速率，但是增加空隙的尺寸也會增大損失WBC的風險。較小的空隙尺寸確保了更有效的捕獲WBC，但是也會減慢RBC和血小板的通過速率。根據應用的類型，可以使用不同的幾何形狀。對於本方法而言，可以使用的微柱直徑為約10至30μm，例如約15至24μm，例如10、12、15、17、20、22、24、25或27μm。微柱之間的空隙或間隔為約10至40μm，例如20至32μm，例如15、20、25、30、35或40μm是有效的。

可以使用多種方法生產微柱陣列。例如，可以通過對基底如玻璃、金屬或聚合物進行模製、電鑄、蝕刻或鑽孔來形成微柱陣列。例如，可以使用簡單的微製造技術如聚(二甲基矽氧烷)(PDMS)軟光刻、聚合物鑄造(例如使用環氧樹脂、丙烯酸樹脂或聚氨酯)、注射模製、聚合物熱壓花、雷射顯微機械加工、薄膜表面顯微機械加工、對玻璃和矽進行深蝕刻、電鑄以及3-D製造技術如立體光刻製造本申請所述裝置的通道和微柱陣列。這些裝置中的大部分使用光掩模複製微特徵。

對於大於5μm的特徵尺寸而言，可以使用基於透明度的乳液掩膜。特徵尺寸為2至5μm之間可能需要基於玻璃的鉻光掩膜。對於更小的特徵而言，可以使用基於玻璃的電子束直寫掩膜。然後將掩膜用於在矽或玻璃的情況下定義蝕刻的光致抗蝕劑圖樣或者定義複製陰模，例如使用SU-8光致抗蝕劑，然後可以將其用作聚合物材料如PDMS、環氧樹脂和丙烯酸樹脂的複製模製母版。然後可以將預製的通道連接至剛性基底如玻璃上以完成該裝置。其他製造方法是本領域公知的且本申請所述的裝置可以由單一材料或材料的組合製造。

使用深反應性離子蝕刻在矽晶片上設計和製造特定的第一階段流體力學分選晶片。使用陽極結合玻璃蓋密封晶片以形成微流體減積部件。使用定製的聚碳酸酯歧管形成與基底和第二階段細胞捕獲室的流體連接。

第二階段——細胞捕獲室

在不同實施方式中，細胞捕獲室可以是使用血小板結合部分將一個或多個壁和/或底板官能化的簡單的微流體通道，或者可以是更精細的且包括混合結構以增強和增加樣品流體中的血小板相關CTC與血小板結合部分接觸的數量。

如圖3中所示，細胞捕獲室可以形成使用抗血小板抗體官能化的產生微渦流的「人字形」室(或「晶片」)，用於高通量捕獲血小板相關的CTC(參見PCT申請公開號WO 2010/036912)。在這種實施方式中，該室形成在微流體裝置中形成的微通道，其中形成延伸進入(或離開)微通道的壁的凹槽(或突起)，以便在流過通道的流體中產生促進在流體中懸浮的任意細胞與通道壁的內表面之間相互作用的流動模式。增加的相互作用可以導致在通道中捕獲的CTC數量的增加，並因此導致微流體裝置的總捕獲效率提高。在這種實施方式中，將微流體裝置的捕獲效率定義為在通道中捕獲的CTC數量與流過通道的細胞總數的比值。

通過調整微流體裝置的結構特徵(包括例如裝置基底材料、通道和凹槽尺寸等)以及流體流動參數(如基於顆粒類型和其中混懸了顆粒的流體類型的流動速率)能夠進一步提高效率。

圖3描述了使用軟光刻技術生產的此類微流體裝置的示例。如下文所述，通過在微通道的一個或多個壁、底板和/或頂板中形成凹槽，將血小板結合部分包覆於微通道的壁、底板和/或頂板的內表面上以及使樣品流體流過微通道將血小板相關的CTC捕獲於細胞捕獲室的微通道中。

圖3顯示了具有延伸入裝置300的通道315的上壁(或頂板)的凹槽335、340的微流體裝置300。在一些實施方式中，細胞捕獲室包括從壁向外延伸的突起(例如，V形突起)，而不是延伸入通道315的壁中的凹槽。在一些實施方式中，對稱凹槽335包括兩個臂，其分別跨過第一末端350和頂點345以及第二末端355和頂點345之間的長度。在示例性的實施方式中，兩個臂之間的角α為90°。在一些實施方式中，兩臂之間角α的範圍在10°至170°之間。在一些實施方式中，微流體裝置300可以包括與下基底310結合的上基底305，其均可以使用適宜材料製造。例如，上基底305可以使用彈性體製造，例如聚二甲基矽氧烷(PDMS)，以及下基底可以使用玻璃、PDMS或其他彈性體製造。

或者或此外，可以使用塑料生產基底，例如聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、聚碳酸酯、環烯烴共聚物(COC)等。在通常情況下，選擇製造上基底和下基底的材料可以是易於生產例如易於蝕刻且能夠提供便於測試的光學性質例如可以是光學透明的，並且可以是無毒的，以使得對於附著於基底上的細胞不具有負面影響。此外，該材料優選無自發螢光或具有有限的自發螢光。而且，該材料能夠易於管能化，使得分析物可以附著於基底。此外，該材料可以具有機械強度，以便向微流體裝置300提供強度。上基底305可以牢固地緊固至下基底310，其間形成微通道，如下文所述。

在一些實施方式中，微通道315可以具有包括兩個側壁320和325以及在上基底305中形成的上壁330的矩形橫截面。使用相對位置的術語例如「上」和「下」以便於描述和表示附圖中的位置而不是特徵的必要相對位置。例如，可以將該裝置定向以使得凹槽位於通道的底表面上或者使得通道的中心軸線垂直延伸。或者，微通道315的橫截面可以是幾種形狀中的一種，包括但不限於三角形、梯形、半月形等。一旦連接至上基底305，下基底310可以形成微通道315的下壁。在一些實施方式中，微通道315包括在微通道315的上壁330中形成的多個凹槽335。或者，凹槽335可以在任意壁中形成，和/或可以在微通道315的一個以上壁中形成。凹槽335可以跨過壁的整個長度，或者僅跨過壁的一部分。

圖4A-4D是顯示顆粒懸液流過具有平壁的微通道和具有在壁中形成的凹槽的另一個微通道的示意圖。圖4A顯示了包括具有矩形橫截面的微通道405的微流體裝置400。微通道405的壁不包括如對於微流體裝置300所描述的那些凹槽，即壁的表面是平的。圖中顯示了流過微通道405的含有懸浮於流體中的血小板相關的靶細胞425的顆粒懸液。而相反的是，圖4B顯示了流過微流體裝置300的類似懸液。

當流體流過由凹槽335在微通道315內排成一列形成的人字形圖案時，在流體路徑中的凹槽335破壞了流體流動。在一些實施方式中，根據流速和凹槽的尺寸，特別是例如凹槽的大小以及凹槽兩臂之間的角度，對流體流動的破壞導致在流體中產生了微渦流。產生微渦流是由於凹槽引起流體沿著橫向於流體流動的主方向(即軸向方向)的方向流動。在一些實施方式中，儘管未產生微渦流，但是凹槽335，340誘導了足夠的破壞以改變部分流體的流動路徑，從而增加了壁與顆粒之間的相互作用。

沒有任何凹槽時，如圖4C中所示，混懸於流體中的血小板相關的靶細胞425以基本上線性的形式通過平的微通道405，使得僅靠近流場邊緣(例如緊鄰微通道405的壁)的那些顆粒425可能與結合至微通道205的壁的抗體發生了相互作用。而相反的是，如圖4D中所示，穿過人字形凹槽圖案的血小板相關的靶細胞425的流徑被流體中的微渦流所破壞，增加了細胞與結合至壁和/或凹槽的抗體之間相互作用的數量。微渦流受到在微流體裝置300的上壁315中形成的各凹槽335的結構特徵的影響。

第二階段的人字形晶片可以使用如此前所述的軟光刻技術由結合至玻璃基底的PDMS製成。然後可以利用抗生物素蛋白-生物素化學使用抗-CD41抗體(Abcam)將晶片表面官能化。

可以在單一晶片上製備第一階段流體力學分選晶片和第二階段人字形晶片，或者可以將其製成單獨的晶片並通過導管連接，如塑料管或其他管。

實施例

在下述實施例中對本發明進行進一步描述，其對於在權利要求中描述的本發明的範圍不構成限制。

實施例1——從臨床樣本中分離CTC

對本方法進行測試以確定其從不同類型的癌症中分離CTC的效率。

根據經機構審查委員會(TRB)批准的方案招募晚期肺癌、乳腺癌和黑色素瘤患者。將所有標本收集至含有抗凝劑EDTA的(Becton-Dickinson)管中，並在抽血4小時內使用微流體晶片對其進行處理。收集血液後立即加入額外的血小板抑制劑如茶鹼、腺苷、雙嘧達莫、阿加曲班和前列腺素I2。將固定的血液樣品直接收集至BCT管(Streck)中。

將樣品在上文所述的兩階段微流體系統上運行。特別地，使用深反應性離子蝕刻在矽晶片上製造第一階段流體力學分選晶片。使用陽極結合玻璃蓋密封晶片以形成微流體室。使用定製的聚碳酸酯歧管形成與微晶片的流體連接。我們測試了微柱之間的空隙為20或32μm的兩個不同的陣列配置。具有20-μm空隙的陣列幾乎保留了所有的有核細胞且具有極少的汙染RBC，但是其將大於21μm的細胞截留並因此可能失去較大的CTC或CTC簇。而相反的是，具有32-μm空隙的陣列對於8至30μm之間的細胞具有擴展的操作範圍，但是僅保留了60％的WBC。由於在32-μm空隙的陣列中失去的細胞是小於所報導的CTC尺寸的粒細胞和淋巴細胞，因而我們選擇該陣列作為CTC的分離系統。

第二階段的人字形晶片是使用如此前所述的軟光刻技術由結合至玻璃基底的PDMS製成。利用抗生物素蛋白-生物素化學使用抗-CD41抗體(Abcam)將晶片表面官能化。

結果如圖5中所示，其以圖形的形式顯示了(左側)分別使用EpCAM和CD41抗體捕獲的來自轉移性肺癌患者的32個血液樣品的CTC計數。使用同時進行CTC鑑定和血小板表徵的四色染色測定對晶片上捕獲的所有細胞進行了處理。將針對腫瘤標記物(EpCAM、鈣粘蛋白-11)和DAPI為陽性，同時針對造血標記物(CD45)為陰性的所捕獲的細胞評分為CTC。在32例的21例中(66％)實現了可靠的CTC捕獲，其計數範圍從0.4至8.5CTC/mL。

相比之下，在使用EpCAM抗體官能化的微流體裝置上平行進行的CTC捕獲顯示了持續較低的陽性命中(圖5，右側)。血小板靶向的方法具有更高的CTC計數是由於本方法具有捕獲可能失去其上皮性質從而難以通過EpCAM抗體靶向的肺CTC的能力。

使用CD61抗體對血小板進行染色以表徵其在CTC表面周圍的分布。使用新系統捕獲的CTC顯示出寬範圍的血小板覆蓋，包括完全被血小板/纖維蛋白包覆的CTC亞群。已將這些血小板覆蓋的CTC假設為高轉移潛能前體，因為血小板增強了腫瘤細胞的存活和增殖，但是其很難通過靶向腫瘤表面抗原的常規陽性選擇方法捕獲。因此，新的系統和方法為捕獲這些CTC提供了新的和改進的技術。

實施例2——不同類型癌症的分離

對微流體平臺進行擴展以便從具有上皮(乳腺)和非上皮(黑色素瘤)腫瘤來源的不同類型癌症患者中分離CTC。使用與肺癌患者的樣品相同的方案對乳腺CTC進行鑑定，但根據此前的報導使用靶向黑色素瘤特異性抗原(CSPG4、MCAM、TYRP1和α-SMA)的抗體混合物對黑色素瘤CTC進行染色。初步的結果表明針對這兩種癌症類型均具有可靠的CTC捕獲(5例乳腺樣品中的3例，計數範圍從0.9至2.7CTC/mL；6例黑色素瘤樣品中的5例，計數範圍從1.4至17CTC/mL)。與肺癌的結果類似，使用目前方法捕獲的所有CTC均與不同程度的血小板覆蓋相關。

如上文所討論的，使用EpCAM/鈣粘蛋白-11(綠色)作為上皮和間葉標記物對肺和乳腺CTC進行鑑定，但使用CSPG4、MCAM、TYRP1和α-SMA(綠色)抗體的混合物對黑色素瘤CTC進行染色。分別使用CD45(紅色)和CD61(綠色)對WBC和血小板進行染色。顯微鏡成像清楚地顯示了所捕獲的各種類型的CTC(結果未顯示)。

因此，所測試的系統能夠從具有上皮(肺、乳腺)和非上皮(黑色素瘤)腫瘤來源的轉移性癌症患者中以單個細胞或細胞簇的形式可靠地捕獲CTC。這些結果表明血小板靶向的CTC捕獲對多種類型的癌症是有效的。

實施例3——抗凝劑和CTC純度

潛在地限制血小板靶向方法性能的一個關鍵問題是與其他技術相比相對較低的CTC純度。在晶片上觀察到了大量的汙染WBC(>105/mL)，這使得下遊的分析非常具有挑戰性。使用血小板特異性抗體染色顯示大部分捕獲的WBC還被血小板包覆。這些稱為血小板-白細胞聚集物(PLA)的形成源自自發性的血小板活化和隨後的p-選擇素的表達，其然後將結合至白細胞表面上的PSGL-1受體。PLA無法通過基於尺寸的分選除去，並且其與血小板相關的CTC一起被抗血小板抗體捕獲。

為了減少WBC的汙染和提高CTC的純度，我們測試了多種用於穩定血液的血小板抑制劑，如茶鹼、腺苷、雙嘧達莫、阿加曲班和前列腺素I2。使用基於EpCAM的捕獲作為對照以評估每mL血液樣品中的WBC數量。這些結果如圖7的左側一列所示。基於EpCAM的捕獲通常導致較少的WBC汙染，儘管這種CTC分離方法具有上文討論的多種缺陷。使用多種血小板抑制劑對基於血小板的捕獲進行測試，結果如圖7中的右側一列所示(實心圈表示未處理的樣品)。發現EDTA與前列腺素I2的組合(如圖中的空心三角所示)有效抑制PLA形成，並且使汙染WBC的數量減少90％(圖7)。

為了完全抑制PLA形成，在處理前將血液樣品在BCT管中固定24小時，其產生用於基於血小板的捕獲的最佳CTC純度。將這些樣品稱為「固定的血液」(空心圈)。

圖8A和圖8B顯示了含有映射至其在微流體裝置上的相對位置的各個所捕獲的WBC(黑點)的微流體裝置的熱圖。未處理的血液樣品存在較強的衰減圖案，大多數所捕獲的細胞位於裝置入口處，這表明WBC與CD41抗體之間通過表面的血小板存在特異性相互作用(圖8A)。而相反的是，經前列腺素I2處理的血液樣品的熱圖顯示出明顯更少的捕獲細胞，其隨機分布於整個裝置中(圖8B)。

而且，通過使用市售血液穩定溶液(例如Streck的BCT管)輕柔固定血液樣品，能夠抑制大部分處理過程中形成的PLA，因為其使得血小板完全失活，從而將CTC的純度基本上提高至與常規EpCAM靶向捕獲相當。在這些研究中，CTC捕獲不受影響，因為TCIPA已在體內條件下發生並且這些血小板相關的聚集物已在採血前形成。

對於血小板-WBC聚集物的這種解決方案改進了設計用於實現血小板靶向的CTC捕獲的兩階段微流體平臺的結果。

其他實施方式

已描述了多個本發明的實施方式。然而，應當理解，在不脫離本發明的主旨和範圍的前提下可以進行各種修改。因此，其他實施方式在所附權利要求的範圍內。