黃鱔血清轉鐵蛋白及其製備方法與用途的製作方法
2023-05-19 15:25:36
專利名稱:黃鱔血清轉鐵蛋白及其製備方法與用途的製作方法
黃鱔血清轉鐵蛋白及其製備方法與用途技術領域
本發明屬於生物領域,公開了一種血清轉鐵蛋白的提取方法、結構和功能,具體地說是一種具有抗帕金森病活性、抗菌活性、抗衰老活性、和提高免疫作用的黃鱔血清轉鐵蛋白及其提取製備方法。
背景技術:
轉鐵蛋白是一簇具有多種生物活性的球蛋白,主要包含三種典型蛋白鳥類卵清及血清中的卵清轉鐵蛋白,哺乳動物乳清中的轉鐵蛋白和脊椎動物血清中的血清轉鐵蛋白。此簇蛋白都具有很好的增強機體免疫力的生理功能,能促進嬰幼兒對鐵及營養物質的吸收,有效防止貧血,抑制腸道致病菌和病毒體內自由基的生成,緩解類風溼關節炎和抗哀老。
黃鱔(Monopterus albus),屬合鰓魚目,合鰓魚科,黃鱔屬。亦稱黃鱔、羅鱔、蛇魚、 長魚。為熱帶及暖溫帶魚類。分布在中國東南部地區,在國外主要分布於泰國、印度尼西亞等東南亞地區。利用黃鱔來提取血清轉鐵蛋白,並將其製成有一定藥理活性的藥品或功能性保健食品,前景非常廣闊。
據《本草綱目》記載,魚類有補血、補氣、消炎、消毒、除風溼等功效。文獻報導,魚類富含DHA和卵磷脂等構成人體各器官組織細胞膜的主要成分,而且是腦細胞不可缺少的營養。黃鱔所含的特種物質「黃鱔素」,能調節血糖,加之所含脂肪極少,因而是糖尿病患者的理想食品。常吃魚類有很強的補益功能。黃鱔的血還可以治療口眼歪斜。因此,我們選擇在我國分布廣泛的魚類作為研究對象。
文獻報導,皮建華製備了鱔魚抗H血清(皮建華,部於川,鱔魚抗H血清的製備,中國法醫學雜誌,1998. 13 ))。諸葛燕等對七種淡水魚(草魚,蘭氏鯽,團頭魴,黃顙魚,鱔魚,泥鰍和北美白金鴨嘴)中天然色素和酪氨酸酶的活性進行了比較(諸葛燕,七種淡水魚中天然色素和酪氨酸酶活性的比較,上海水產大學學報,2008)。
關於血清蛋白的研究報導,李亞南等於2001年對嗜水產氣單胞菌誘導的草魚免疫球蛋白進行了分析。分析時分為兩組一組樣品經飽和硫酸銨分級沉澱、透析和電泳分析,另一組G-200柱層析分離及電泳分析(李亞南.嗜水產氣單胞菌誘導的草魚免疫球蛋白分析[J].動物學報,2001,47 O) :132-138)。馮娟等人於2002年利用ftOtein A-sepharose親和柱層析一步法,對四種海水養殖魚類的血清免疫球蛋白首次進行了分離純化及分子量測定。層析曲線的洗脫峰值說明牙鮃血清的Ig同紫紅笛鯛、青石斑魚、尖吻鱸3種暖水性魚類血清的Ig在結構和功能上有明顯的差異(馮娟,四種海水養殖魚類血清免疫球蛋白的分離純化及分子量測定.熱帶海洋學報,2002. 2K4))。2004年,李雅娟等人對黃顙魚雌、雄個體血紅蛋白進行了電泳分析。結果表明黃顙魚雌、雄個體血清蛋白存在明顯差異,表現在B1區雄性個體比雌性個體多1條MI帶(染色較淺的帶)。雌、雄個體血紅蛋白只能分離出1條譜帶,並且雌、雄之間基本沒有差異(李雅娟等,黃顙魚雌、雄個體血紅蛋白的電泳分析,吉林農業大學學報,2004. 26 (3) =339-342)。
本專利的研究對象是人們經常食用的魚類,人們主要是食用其肉質,血的利用率較低。為了提高魚類血的利用率,通過研究其血清蛋白,開發一種具有藥理活性的產品,是十分必要的。發明內容
本發明的目的是提供黃鱔血清轉鐵蛋白及其提取、分離和純化方法。
本發明的另一目的是提供該血清轉鐵蛋白的用途。
本發明目的是這樣實現的
(1)血清的製備取黃鱔新鮮血液在10°C 25°C下靜置1 濁沉澱,得深紅色塊狀物質;然後在O 4°C下靜置12 24h後離心,棄去血細胞,取上清液即血清;
(2)球蛋白的提取先將血清採用鹽析法提取,步驟為,加入0.8 1.2倍體積飽和鹽溶液,混合均勻,於0 10°C靜置,使之充分沉澱,冷凍離心,棄去上清;
以0. 008 0. 012mol/L、pH值6. 8 7. 2的磷酸鹽(PBS)緩衝液溶解沉澱,再逐滴加入0. 8 1. 2倍體積的飽和鹽溶液,混勻,在0 4°C靜置沉澱,得蛋白粗提物;優選的飽和鹽溶液為飽和硫酸銨、飽和辛酸-硫酸銨溶液或飽和硫酸鈉溶液。
(3)蛋白純化採用離子交換柱層析純化。
層析介質用pH值6. 8 7. 2,0. 008 0. 012mol/L的PBS緩衝液充分平衡,裝柱; 離子交換柱的層析介質優選為陰離子交換樹脂或DEAE-纖維素。
樣品準備將蛋白粗提物溶於0. 01 0. lmol/L、pH為6. 0 7. 8的PBS緩衝液中,先用層析柱起始緩衝液(PBS 0. 008 0. 012mol/L, pH6. 8 7. 2)透析,0 10°C環境中進行。
上樣將蛋白液在控制流速下加到柱上。洗脫速度0. 1 0. 5ml/min ;以0. 01 0. lmol/L、pH值6. 8 7. 2的磷酸鹽緩衝液梯度洗脫,分段收集洗脫液,紫外檢測,合併洗脫峰,濃縮,得目標蛋白。
利用圓二色譜對所得的黃鱔血清轉鐵蛋白的二級結構進行測定,結果顯示,含 α -螺旋四.8 %,β -摺疊6. 6 %,分子量為74KD。
黃鱔血清轉鐵蛋白的用途研究通過行為學實驗,運用計時的方法進行評價。實驗表明,該蛋白對帕金森症有明顯改善作用。在正常情況下用血清轉鐵蛋白處理小鼠,可明顯促進腹腔巨噬細胞的吞噬功能,提高空斑形成細胞的溶血能力。可做免疫增強劑,作為免疫功能衰退與缺陷的防治藥物。通過轉鐵蛋白對衰老小鼠免疫器官的影響實驗可以發現,該蛋白能明顯拮抗衰老模型小鼠胸腺及脾臟的萎縮。將Ε. coli和St. aureus菌種分別接種於肉湯蛋白腖液體培養基中,發現血清轉鐵蛋白有一定的抑菌作用。從以上敘述可以看出, 黃鱔血清轉鐵蛋白有一定的藥理活性,可作為生產藥品、功能性保健食品的原料。
血清轉鐵蛋白的用途研究包括關於帕金森模型的行為學實驗、免疫學實驗、抗衰老模型試驗和抗菌實驗。
行為學實驗可以為爬杆實驗、遊泳實驗、懸掛實驗、Y型電迷宮實驗中的一種和幾種。
抗衰老實驗可以採用壽命試驗法,老化相關酶測定法,老化代謝產物測定法中的一種和幾種。
本發明的要點是以魚類的血為原料,根據其他動物血清蛋白的提取方法,結合一些物理化學研究手段,得到較純的血清轉鐵蛋白。
本發明優點在於該血清轉鐵蛋白不但具有抗帕金森症、提高免疫力的藥理活性, 而且有抗衰老、抑菌的功能。這樣不僅提高了黃鱔血的利用率,探索了一種對帕金森病人行為能力有改善作用、可作為免疫增強劑的藥,還可作為抗衰老、抗菌的功能性原料。本發明原料易得、加工工藝簡單,可以考慮將其開發成一種藥品或功能性保健食品。
具體實施方式
下面通過實施例對本發明做進一步說明。實施例主要包括兩個方面一方面是蛋白的提取、分離和純化;另一方面是蛋白的藥理實驗。
實施例1
血清的製備與球蛋白的提取,工藝如下
(1)血清製備取約IOOml黃鱔新鮮血液置於15°C環境中lh,靜置沉澱,得深紅色塊狀物質。然後將血液放入冰箱G°c),靜置12h。離心,棄去血細胞,取上清液,即血清。
b球蛋白提取
先將血清採用鹽析法提取一遍加入等體積飽和硫酸銨溶液,4°C靜置,沉澱,棄去上清;
以0. 01mol/L、pH為6. 8的PBS緩衝液溶解沉澱,再逐滴加入等體積的飽和硫酸銨溶液,搖勻,在4°C靜置,沉澱,得蛋白粗提物。將蛋白粗提物溶於0. Olmol/L、pH為6. 8的 PBS緩衝液中,於4°C冰箱保存。
實施例2
血清蛋白的純化,工藝如下
a採用陰離子交換柱層析純化球蛋白。離子交換劑DE52用pH值7.02、0.01mol/L 的PBS緩衝液充分平衡,裝柱。
b樣品準備實施例1所得到的硫酸銨沉澱蛋白粗提物溶液先用層析柱起始緩衝液(PBS 0. 01M, ρΗ7· 02)在4°C環境中進行透析。
c上樣將透析後的蛋白樣品溶液在控制流速下加到柱上(上樣速度為0. 3ml/ min)。上樣量 IOmg (約 4ml),洗脫速度 0. 3ml/min ;以 0. 01 0. lmol/L、pH 值 7. 02 的磷酸鹽緩衝液梯度洗脫(起始的磷酸鹽緩衝液濃度0. Olmol/L.pH值7. 02),每管收集5ml,紫外檢測,檢測波長254nm,收集洗脫峰,濃縮,得目標蛋白。結果顯示本發明實施例產品經紫外分光光度法測定,濃度為0. 750mg/ml ;經圓二色譜測定,結合JASCO J-715型圓二色譜系統分析軟體計算可知,α-螺旋的含量為四.8%,摺疊的含量為6. 6%;經質譜檢測,分子量為74kD,純度90%以上。
實施例3
實施例2血清轉鐵蛋白的行為學試驗,實驗操作如下
a採用爬杆法,運用計時的方法進行評價。試驗時首先手持小鼠尾巴,令其倒立於爬杆的頂端,用秒表記錄小鼠白杆頂爬至杆底(前爪觸底)所用時間。小鼠適應訓練4天, 記錄第1次MPTP注射前1天,造模後7、14天的爬杆時間。每次記錄前,先讓小鼠適應爬行 2次後進行測量,一般測量3次,記錄連續爬行時間最短的1次進行統計;如遇小鼠出現中途停頓或反向攀爬,則重新測量。統計數據為各組造模後不同時間點爬杆時間減去造模前爬杆時間,即得到的差值(造模前後變化值),其中建模後爬杆時間延長用正值表示,縮短用負值表示。
結果顯示小鼠造模後7天和14天,與模型組比較,本發明實施例血清轉鐵蛋白高劑量組差異有統計學意義(P < 0.01),血清轉鐵蛋白中、低組的爬杆時間均有改善,但差異無統計學意義。
表1各組小鼠造模後不同時間爬杆時間測定結果比較
權利要求
1.黃鱔血清轉鐵蛋白的製備方法,其特徵在於,包括如下步驟(1)血清的製備取黃鱔新鮮血液在10°c 25°C下靜置1 池沉澱,得深紅色塊狀物質;然後將血液在O 4°c下靜置12 24h後離心,棄去血細胞,取上清液即血清;(2)球蛋白的提取將步驟(1)得到的血清用鹽析法提取,取沉澱;以0.008 0. 015mol/L、pH值6. 8 7. 2的磷酸鹽緩衝液溶解沉澱,再逐滴加入0. 8 1. 2倍體積的飽和鹽溶液,搖勻,在0 4°C靜置,沉澱為蛋白粗提物;(3)將蛋白粗提物溶解並透析後用離子交換柱層析純化,以0.01 0. lmol/L、pH值 6. 8 7. 2的磷酸鹽緩衝液梯度洗脫,分段收集洗脫液,合併洗脫峰。
2.權利要求1所述黃鱔血清轉鐵蛋白的製備方法,其特徵在於,步驟(3)中所述的離子交換柱的層析介質為DEAE-纖維素或陰離子交換樹脂;層析介質用起始緩衝液充分平衡、裝柱;所述起始緩衝液為pH值6. 8 7. 2,0. 008 0. 012mol/L的磷酸鹽緩衝液。
3.權利要求1或2所述黃鱔血清轉鐵蛋白的製備方法,其特徵在於,步驟C3)中蛋白粗提物用pH值6. 8 7. 2,0. 008 0. 012mol/L的磷酸鹽緩衝液溶解和在0 10°C透析後, 用離子交換樹脂層析純化。
4.權利要求1所述黃鱔血清轉鐵蛋白的製備方法,其特徵在於,步驟( 所述飽和鹽溶液為飽和硫酸銨、飽和辛酸-硫酸銨或飽和硫酸鈉溶液。
5.權利要求1所述黃鱔血清轉鐵蛋白的製備方法,其特徵在於,步驟( 所述鹽析提取方法為向血清中逐滴加入0. 8 1. 5倍的飽和鹽溶液,混合均勻,於0 10°C靜置,使充分沉澱,冷凍離心,棄去上清,取沉澱。
6.一種黃鱔血清轉鐵蛋白,其特徵在於,通過權利要求1 5任一項所述的方法製備, 所得蛋白的分子量為74KD,該蛋白的二級結構中含α-螺旋四.8%,β-摺疊6.6%。
7.權利要求6所述黃鱔血清轉鐵蛋白在製備抗菌劑方面的應用。
8.權利要求6所述黃鱔血清轉鐵蛋白在製備治療帕金森病藥物方面的應用。
9.權利要求6所述黃鱔血清轉鐵蛋白在製備治療免疫增強劑方面的應用。
全文摘要
本發明公開了一種黃鱔血清轉鐵蛋白的提取方法,為取黃鱔新鮮血液在15℃~25℃下靜置製備血清、採用鹽析法提取球蛋白和用離子交換柱層析純化蛋白。這種黃鱔血清轉鐵蛋白的二級結構含α-螺旋29.8%,β-摺疊6.6%,經過SDS-PAGE測得分子量為74KD,具有抗帕金森病活性、抗菌活性、抗衰老活性和提高免疫作用。
文檔編號C07K1/30GK102492034SQ20111037774
公開日2012年6月13日 申請日期2011年11月24日 優先權日2011年11月24日
發明者於廣金, 任天瑞, 張雷, 王博文 申請人:上海師範大學