大規模連續生產病毒疫苗的方法
2023-05-18 18:35:26
專利名稱：大規模連續生產病毒疫苗的方法
技術領域：
應用生物反應器大規模培養動物細胞(如CHO，BHK，293細胞，雜交瘤細胞，昆蟲細胞等)已有很多報導。可生產的基因工程產品，如蛋白分泌型產品紅細胞生成素(EPO)和組織型纖溶酶原(t-PA)等均有報導。
然而，由於蛋白分泌型產品和病毒疫苗在培養基配方、生產工藝上存在很大區別，因此現在利用生物反應器來大規模生產病毒疫苗的方法還很少。以人用狂犬疫苗為例狂犬病是一種自然疫源性疾病，是由狂犬病引起的所有溫血動物都易感染的人獸共患性疾病，一旦發病，100％死亡。據世界衛生組織的統計，每年約有30,000人死於狂犬病。據中國衛生部統計，中國2001年狂犬病人的病死率高達95.88％，高居甲、乙類傳染病首位。研製良好的狂犬疫苗不僅可預防狂犬病，也可治療狂犬病。中國國內傳統的狂犬疫苗生產方法是將原代細胞地鼠腎細胞經過滾瓶培養後接種狂犬病毒，然後經濃縮而成。這種生產方法生產的狂犬疫苗品質差，效價低，有些疫苗需要添加佐劑，部分病人接種疫苗後會出現全身性過敏反應，而且免疫和治療效果不十分理想，存在許多後遺症。2001年中國政府已經明令禁止生產和銷售用地鼠腎細胞經過濃縮而灌裝的狂犬疫苗，只允許暫時生產純化後的地鼠腎細胞精製狂犬疫苗。「暫時允許」是指國家將強制執行潔淨動物相關法規，所有的用於生物藥物的動物必須飼養在符合國家標準的動物房內。屆時以地鼠腎細胞為原料的狂犬疫苗的生產成本將大大提高。而國家允許生產和銷售的另一種類型狂犬疫苗就是以傳代細胞Vero細胞(從非洲綠猴腎細胞培養而來)為宿主的狂犬疫苗。目前，國內已有部分單位用轉瓶機工藝來生產Vero細胞狂犬疫苗，並經純化精製而成。但仍然處於起步階段，表現為規模小，成本高，產品批次之間質量相差較大，而且整體質量不穩定。目前國內尚未見到用生物反應器生產狂犬疫苗的報導。
國外目前用生物反應器生產狂犬疫苗主要有兩種工藝方法。(1)在大型細胞培養罐(通常罐體積在800升至1200升之間)中，用Vero細胞作為宿主細胞，用球形微載體(商品名Cytodex-1)作為細胞生長載體，每升培養基只能加入3-5克微載體；批式培養，達到一定細胞密度後接種病毒。這種方法的缺點是顯而易見的每升培養基所加的微載體太少，不能連續培養，生產過程中若造成汙染損失巨大，因而產品成本特高，市場價格相應更高。(2)在可以連續培養的7.5-30升生物反應器裡用一種特別的攪拌槳(商品名Cell-LiftImpeller)，以Vero細胞為宿主細胞，球形微載體(商品名Cytodex-1)作為細胞生長載體，每升培養基可加入25克微載體，連續培養，連續收穫。此方法比較前一種雖然有改進，但在生物反應器上要配細胞沉降系統，而且微載體最多只能重複使用兩次，設備投資較大，生產過程中耗材成本較高。
因此，本領域中仍然需要有一種成本更低的大規模連續生產諸如狂犬疫苗等病毒疫苗的方法。
發明內容
本發明的目的就是提供一種成本更低的大規模連續生產病毒疫苗的方法。
本發明涉及一種大規模連續生產病毒疫苗的方法，其特徵在於，該方法包括下列步驟a)在具有固定床籃式攪拌系統的Celligen Plus生物反應器中，以聚酯切片Fibra-CelTMDisks為載體，培養用於生產病毒的細胞；b)在細胞生長至一定密度時，接種所述病毒，使所述病毒感染細胞；c)使病毒增殖；d)純化收穫病毒。
在本發明的方法中，所用的Celligen Plus生物反應器是購自New BrunswickScientific Co.，Inc.公司的生物反應器。該生物反應器中裝有固定床籃式培養系統(商品名為固定床籃式攪拌系統(Fibrous-Bed Basket System))，該培養系統是一種用於細胞培養的攪拌系統，其特點在於a)攪拌時形成的剪切力非常低，尤其在50-120rpm之間作用在細胞上的剪切力幾乎為零；b)設計有專門的氣體迴路，當培養細胞過程中需要向生物反應器通入各種氣體，例如空氣，氧氣，二氧化碳和氮氣時所產生的氣泡會沿著特定的迴路進出，而不會像其他培養系統那樣讓細胞貼在氣泡表面，當氣泡升至液面破裂時，細胞也隨之死亡；c)是唯一可使用聚酯切片載體的細胞培養系統。
本發明方法可採用總體積為5.0升和7.5升的生物反應器，但是本領域技術人員在閱讀了本說明書的描述後可以預計到，體積更大的生物反應器也適用於本發明方法。
本發明方法中採用的載體是由英國BIBBY STERILIN COMPANY生產的聚酯切片載體(Fibra-CelDisks)。該載體成分為50％聚酯非織造纖維和50％聚丙烯片。經發現，該聚酯切片載體可在特定的環境裡提供細胞生長空間。
在本發明中用來生產病毒疫苗的細胞(即，宿主細胞)可以是本領域技術人員所熟知的那些動物細胞，例如CHO細胞，BHK細胞，293細胞，Vero細胞等。
在本發明的一個較佳實施方案中，宜採用Vero細胞作為病毒生產細胞。因為Vero細胞是廣譜宿主細胞，接種狂犬病毒後，可生產狂犬疫苗；接種出血熱病毒，可生產出血熱疫苗；同理，還可生產乙腦疫苗，小兒脊髓灰質炎疫苗，輪狀病毒疫苗等病毒性疫苗。因此預計將本發明廣泛應用於上述疫苗以及其他各種疫苗的生產。
因此，在本發明的一個較佳實施方案中，所述疫苗選自狂犬疫苗、出血熱疫苗、乙腦疫苗、小兒脊髓灰質炎疫苗和輪狀病毒疫苗等病毒疫苗。更佳的疫苗是狂犬疫苗、出血熱疫苗和乙腦疫苗。
在本發明的方法中，首先是在上述生物反應器中，在上述聚酯切片存在下，將生產病毒用的細胞培養至一定密度，然後再進行接種。接種病毒的時間是影響疫苗產量的主要因素之一。在本發明中，接種病毒時細胞密度可在1.0×107-2.0×108/毫升之間。在較佳的實施方案中，接種病毒時的細胞密度為1.0-1.4×108/毫升。在一個特別佳的實施方案中，接種病毒時的細胞密度為每毫升1.2×108個細胞左右(也就是細胞在反應器裡培養了5-7天左右)。
在一個較佳的實施方案中，在接種病毒後，宜在低速攪拌條件下進行培養，以使病毒感染宿主細胞。較佳的，宜在50-100rpm(更佳的在60-80rpm)的攪拌速度下進行培養。
本發明方法比照現有技術的不同特點之一是可以連續培養。在連續培養過程中病毒在宿主細胞(如Vero細胞)中不斷增殖並釋放到培養上清中，通過蠕動泵排到反應器外；與此同時，另一個蠕動泵則把新鮮培養基加入反應器內，以提供細胞生成和病毒增殖所消耗的營養。另一方面，每天加入的培養基的量(灌注量)不能過少，一般需使培養基中的葡萄糖含量保持在2g/L以上(通常在2-3克/升，更通常地在2-2.5克/升)，這樣才能維持高產量的病毒。同時，如果攪拌速度太低，則產量將極大減少甚至導致所有細胞死亡。
本發明方法可分為三個階段1)宿主細胞生長階段、2)病毒感染階段和3)病毒增殖和收穫階段。在這三個階段中所用的培養基組成、培養條件(如溫度，pH，溶氧)等不難由本領域普通技術人員根據所用的宿主細胞類型來加以確定。然而，應注意，病毒增殖階段的溫度和pH應低於前兩個階段的溫度和pH。例如，對於用Vero細胞來生產狂犬疫苗而言，在宿主細胞生長階段和病毒感染階段的pH宜為7.2-7.5(較佳的為7.3)，溫度宜在37℃左右；而在病毒產生階段，pH宜在7.0-7.2(較佳的為7.1)，溫度宜在32-35℃之間(較佳的為34℃)。
在病毒感染後一定時間後，就可開始連續收穫培養上清中的病毒。病毒滴度可用常規手段(如小鼠注射法)來測定。
與現有技術相比，本發明的大規模連續生產病毒疫苗的方法具有培養的細胞密度高、可連續收穫和產量高(平均滴度高)的優點。據報導，在利用轉瓶機培養Vero細胞來生產狂犬疫苗的方法中，每個轉瓶每次收穫300毫升上清液，每個周期每瓶收穫2-3次，收穫周期為9天，汙染率3％，放架率為90％，用於產毒的轉瓶機大約只能佔全部轉瓶機數量的60％。而本發明通過使用150克聚酯載體，相當於150個內表面積為1200平方釐米的轉瓶，可連續培養，每天可以收穫7000毫升上清，而且連續培養時間可長達20天，收穫期汙染率為零。現有技術中接種病毒時的細胞密度僅為1×106細胞/毫升，而本發明方法接種病毒時的細胞密度可達1×108細胞/毫升。綜合可比因素分析對比，本發明方法的產量比現有技術中轉瓶機方法提高了100倍。
具體實施方案給出以下的實施例目的是闡明本發明，但不能解釋成限制本發明的範圍。
實施例1狂犬疫苗的大規模生產在本實施例中，採用的主要設備是5.0升生物反應器(商品名CELLIGEN PLUS，購自美國NEW BRUNSWICK SCIENTIFIC CO.，INC.)。該生物反應器的罐體為夾套式耐高溫高壓玻璃罐體，總體積5升，工作體積3.5升。該生物反應器採用的攪拌系統是固定床籃式攪拌系統(FibrousTM-Bed Basket System)。
本實施例中所用的培養基是M199培養基或DMEM培養基。所用其它試劑包括胎牛血清，胰酶，人血清白蛋白，FeSO4，AlCl3，ZnSO4為分析純試劑，及濾膜，濾芯，矽膠管等為細胞培養常用材料。
從種子細胞庫中復甦1支Vero細胞(由非洲綠猴腎細胞培育出的可傳代的廣譜宿主細胞，購自中國藥品生物製品檢定所)，48小時傳代，用175cm2方瓶擴增到30瓶，使細胞總數達到1-2×109細胞。
在生物反應器罐體中加入150克聚酯切片(Fibra-CelTMDisks，購自NEWBRUNSWICK SCIENTIFIC CO.，INC)作為載體，並加入3.5升磷酸緩衝液PBS(pH7.4)，121℃消毒30分鐘。
消毒後，排空磷酸緩衝液。加入Vero細胞生長培養基(M199+5％FBS(胎牛血清))，並接種種子細胞，在37℃、pH7.2-7.4、溶氧為40-60％、攪拌速度為90-120rpm下進行培養。最大灌流速度為8-10升培養基/天(使培養基中的葡萄糖含量保持在1-2克/升)。
在培養細胞5-7天後，將生長培養基全部抽出，換上病毒生產期培養基(M199，含1％(W/V)人血清白蛋白、1.5克/升葡萄糖、0.5毫克/升FeSO4、0.3毫克/升AlCl3、0.195毫克/升ZnSO4，pH7.3)。以2-10的感染複數(MOI)接種aG狂犬病毒株(購自中國藥品生物製品檢定所)。在37℃、pH7.2-7.4、溶氧為40-60％、攪拌速度為60-80rpm下培養6-8小時，使病毒感染細胞。
然後，在32-35℃、pH7.0-7.2、溶氧為40-60％、攪拌速度為120rpm下進行培養，並恢復接種病毒前的灌注速度，使病毒在細胞中大量增殖。在病毒感染36小時以後，開始收穫含病毒的上清，並用於純化。
上清收穫量為5-8升培養基/天(使培養基中的葡萄糖含量保持在2克/升或以上)，如此可維持連續收穫時間在20天以上。總收穫量為140升病毒上清。用小鼠注射法測得病毒滴度最高可達到9Lg LD50/毫升(半致死量的對數)。
實施例2出血熱病毒疫苗的生產採用與實施例1基本相同的步驟進行本實施例，不同的是採用體積為7.5升的生物反應器，並給Vero細胞接種出血熱病毒疫苗。病毒生產階段的pH為7.0，溫度為33℃。結果收穫得到為250升病毒上清。用直接螢光抗體法測得病毒滴度在8Lg LD50/毫升左右。
上面雖然根據一些具體的較佳實施方案對本發明作了詳細描述，但應認為，本發明並不局限於這些具體的實施例。本領域技術人員在閱讀了上述描述後可在不脫離所附權利要求範圍的條件下對本發明作任何改動。
權利要求
1.一種大規模連續生產病毒疫苗的方法，其特徵在於，該方法包括下列步驟a)在具有固定床籃式攪拌系統的Celligen Plus生物反應器中，以聚酯切片Fibra-CelTMDisks為載體，培養用於生產病毒的細胞；b)在細胞生長至一定密度時，接種所述病毒，使所述病毒感染細胞；c)使病毒增殖；d)純化收穫病毒。
2.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述病毒疫苗選自狂犬疫苗、出血熱疫苗、乙腦疫苗、小兒脊髓灰質炎疫苗和輪狀病毒疫苗。
3.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述接種病毒時的細胞密度為1.0×107-2.0×108/毫升。
4.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於，在步驟b)中，使病毒在攪拌速度為50-l00rpm下感染所述細胞。
5.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述用於生產病毒的細胞選自CHO細胞、BHK細胞、293細胞和Vero細胞。
6.根據權利要求5所述的方法，其特徵在於，所述用於生產病毒的細胞是Vero細胞。
7.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於，在病毒增殖期間維持培養基中葡萄糖含量在2-2.5克/升。
全文摘要
本發明提供了一種大規模連續生產病毒疫苗的方法，該方法包括下列步驟a)在具有固定床籃式攪拌系統的Celligen Plus生物反應器中，以聚酯切片Fibra－Cel
文檔編號A61K39/12GK1390604SQ0211201
公開日2003年1月15日 申請日期2002年6月10日 優先權日2002年6月10日
發明者賈撫, 劉冬連 申請人:上海恩培科學儀器諮詢有限公司