一種基於寡核苷酸修飾的納米金檢測三聚氰胺的方法
2023-04-24 04:27:51 1
專利名稱：一種基於寡核苷酸修飾的納米金檢測三聚氰胺的方法
技術領域：
本發明涉及生物學、醫學、食品學、化學等學科的交叉學科領域，更具體涉及一種
基於寡核苷酸修飾的納米金檢測三聚氰胺的方法。
背景技術：
在寡核苷酸修飾的納米金溶液中，加入互補的靶寡核苷酸發生雜交反應時，將導 致納米金團聚，伴隨溶液顏色和吸光度值的變化，從而實現對靶寡核苷酸的檢測。寡核苷酸 修飾的納米金有很高的消光係數，且溶液的顏色與納米金粒子間的距離密切相關。藉助特 定的寡核苷酸連接臂，能夠將此原理運用於不同的反應體系。本發明正是建立在此原理的 基礎上。前不久，有人報導了一種三聚氰胺的檢測方法(Kelong Ai，Yanlan Liu，and Lehui Lu， Journal of the American ChemicalSociety， 2009， 131 (27) ， 9496-9497.)。該方法中， 用於標記納米金的巰基試劑是一種三聚氰酸的衍生物，尚未商品化,需自己合成和純化，這 就對操作人員提出了很高的要求,不僅勞動強度大，費時費力，且其純度直接影響檢測的靈 敏度和選擇性。本發明所用巰基化寡核苷酸為商品化試劑，檢測結果重現性好，利於推廣使 用。
發明內容
本發明要解決的技術問題就是克服現有檢測三聚氰胺的方法中需要昂貴的大型 儀器，難以實現在線監測，不利於推廣的缺陷，本發明的目的是在於提供了一種基於寡核苷 酸修飾的納米金檢測三聚氰胺的方法，簡便快速,特異性強，靈敏度高。 本發明人經過研究發現，單鏈寡核苷酸在溶液中為無規巻曲狀態,可以吸附在納 米金表面；特定的寡核苷酸序列可以和某些分子特異性結合，選擇性好，靈敏度高。因此可 將寡核苷酸一端用巰基修飾，通過S-Au共價作用連接到納米金表面，構成穩定的檢測靶分 子的納米金寡核苷酸探針。當有靶分子存在時,耙分子與鹼基特異性結合，形成網狀結構， 納米金顆粒間距離減小，引起納米金溶液顏色的變化，直接通過裸眼比色觀測，或藉助紫 外-可見分光光度計，即可實現靶分子檢測。本發明人提出了新的檢測策略利用納米金溶 液顏色隨納米金顆粒間距變化而變化的性質，將其發展成為檢測三聚氰胺的探針，可以很 方便地實現對三聚氰胺的高靈敏檢測，從而完成了本發明。 因此,本發明解決上述技術問題所採用的技術方案是一種基於寡核苷酸修飾的 納米金檢測三聚氰胺的方法，可依次包括以下步驟 1)將能與三聚氰胺特異性結合的寡核苷酸(巰基修飾的含有多個胸腺嘧啶，鹼基 總數為2 100,胸腺嘧啶個數為2 100的寡核苷酸，上海生工)修飾到納米金表面；
2)加入三聚氰胺(me:l.amine， sigma公司)標準溶液或樣品溶液)進行反應；
3)採用目視比色法或紫外_可見分光光度法實現對三聚氰胺的檢測。
本發明步驟1)是將能與三聚氰胺特異性結合的寡核苷酸連接到納米金表面形成 捕獲探針。本發明可實現三聚氰胺的定量檢測,檢出限能夠達到國家標準要求。所述的納米金的粒徑為10 20nm，納米金溶液的反應濃度為1 100nM。反應溫度為10 38°C ，反 應時間為50 60小時。本發明所述的寡核苷酸是具有特定鹼基序列的單鏈寡核苷酸，該 單鏈寡核苷酸具有特異的核酸結構，可與三聚氰胺特異性結合，從而形成交聯的納米金網 絡結構，該結構下納米金迅速沉澱，引起溶液顏色變淺，從而實現對三聚氰胺的檢測。所述 的納米金與寡核苷酸的濃度比為1 : 50 1 : 150。與常用方法相似，步驟l)所述的含巰 基的寡核苷酸修飾納米金反應體系中，需加入緩衝溶液，該緩衝溶液為PBS或Tris-乙酸或 胂酸鹽，反應濃度為10 20mM。同時需要加入NaCl以更好的滿足寡核苷酸對納米金的修 飾，反應濃度為0. 1 1. M。反應過程中引入1 u M 1mM半胱氨酸或穀胱甘肽，可改善納 米金寡核苷酸探針的穩定性。 本發明歩驟2)為向步驟1)的寡核苷酸修飾的納米金探針溶液中加入待測溶液
進行反應。其中，所述的待測溶液的反應濃度為10 3 10 7M。反應溫度為70 IO(TC，反
應時間為3 7分鐘。所用緩衝溶液為Tris或P:BS,或胂酸鹽緩衝溶液，反應濃度為1
100mM。同時根據需要可加入NaCl以更好地滿足三聚氰胺與寡核苷酸的結合。本發明步驟3)為將步驟2)的反應液冷卻至室溫，稀釋(5 50倍)，通過目視比
色法或測定紫外可見吸收光譜實現對三聚氰胺的檢測。溶液顏色變淺的,含有三聚氰胺；顏
色越淺，三聚氰胺含量越多；52nM處吸光度降低的，待測溶液含三聚氰胺，呈陽性。 本發明將牛奶製品中可能存在的幹擾物質添加到步驟2)的樣品溶液中進行對照實驗。 本發明的整個反應體系可控制在微升級別，體積為20 800微升，優化實驗方 案可表述如下取28uL巰基修飾的特異性寡核苷酸(濃度為10—3 10—6M)緩慢加入到 60. OmL納米金溶液(粒徑10 20線反應濃度在1 100nM ;Au : DNA的摩爾比例範圍在 1 : 50 150)中，孵育10 20小時，然後加入90. OmL緩衝溶液溶解的另一巰基小分子， 繼續孵育30 50小時，利用緩衝溶液清洗，濃縮，得到納米金寡核苷酸探針。緩衝溶液為 常用的Tris或PBS或胂酸鹽緩衝溶液，NaC:l.濃度為0. 1 1. 0M。向luL納米金寡核苷酸 探針溶液中加入20uL濃度為10—3 10—7M的三聚氰胺溶液，混合均勻，加熱到95t:後反應 2 10分鐘，緩慢降到室溫(23 26tO。同時以不加三聚氰胺溶液一組，添加牛奶中可能 存在的幹擾物質的若干組作為對照。然後分別在上述溶液中加入400uL去離子水,通過目 視比色法或利用紫外吸收光譜進行檢測。 本發明的基本原理可總結為利用寡核苷酸能夠與三聚氰胺特異性結合,納米金 溶液顏色與納米金顆粒分散狀態密切相關，及寡核苷酸可以通過巰基連接到納米金表面的 性質，實現了對三聚氰胺的檢測。首先設計該特異性寡核苷酸修飾的納米金探針，加入三聚 氰胺後，通過三聚氰胺與鹼基的結合形成交聯的納米金網絡結構。分散的納米金溶液呈現 紅色，團聚後變紫或變蘭，很快沉澱；團聚後的納米金溶液在單分散的納米金對應的紫外特 徵吸收波長處的吸光度值顯著降低。本發明的檢測原理圖可參見圖1。
與現有技術相比，本發明的優點如下 1)本發明改變了目前常用的檢測三聚氰胺的檢測模式,無需使用昂貴的大型儀 器，節約了成本。與前段時間報導的檢測三聚氰胺的方法相比(Kelong Ai,Yanlan Liu，and Lehui Lu， Journal of the American Chemical Society 2009，131 (27)，9496-9497.)，使 用已商品化的巰基化寡核苷酸標記納米金，無需自己合成巰基試劑，避免了因合成技術不成熟帶來的實驗結果重現性差，檢測誤差大等問題，可實現實際樣品的準確檢測。 2)本發明的檢測方法具有高度特異性，能夠有效避免實際樣品中可能共存物質的
幹擾，實用性強。 3)本發明的檢測方法靈敏度高，檢出限可達到46. 5nM，達到國家標準要求。
4)本發明檢測快速。納米金寡核苷酸探針穩定、易存放，易於實現批量商品化生 產，直接採用此寡核苷酸修飾的納米金探針對三聚氰胺進行檢測，整個檢測過程不超過10 分鐘。 5)本法測定三聚氰胺的線性範圍4. 65 X 10-7 4. 65 X 10-4，線性相關係數 0.9890。
以下結合
本發明的特徵和優點。
圖1是本發明的檢測原理示意圖。 圖2是本發明用於檢測三聚氰胺的紫外吸收光譜圖(A)，工作曲線(B)，目視比色 法觀察結果(C)及幹擾離子的容許倍數(D)。
具體實施例方式
下面用本發明對三聚氰胺檢測的具體實施來進一歩說明本發明。其中未註明具體 條件的實驗方法，通常按照常規條件或按照製造廠商所建議的條件。本發明中的室溫是指 進行實施操作的實驗室溫度，為23 26°C . 紫外-可見光譜檢測:UV-2550 Spectrophotometer (SHIMADZU, Japan)，掃描波長 範圍:400 750nm，用600uL石英比色皿，取430uL反應液進行測定。 本發明實施中所用的納米金參考文獻(K. C. Grabar， R. G. Freeman, M. B. Hommer， M.丄Natan，Anal Chem 1995， 67, 735-743)製備。具體步驟如下，將lOOmL超純水加熱到沸 騰後加入1.88mL 1% (w/w)氯金酸溶液。再次沸騰後在劇烈攪拌下迅速加入10.0mL檸檬 酸三鈉水溶液(檸檬酸三鈉的質量為0. 1141g)並繼續加熱攪拌lOmin，溶液變成酒紅色。 停止加熱後攪拌15min，靜置冷卻到室溫。然後用0. 22 y m濾膜過濾，放置在冰箱中4"C保 存。本方法得到粒徑為10 2nra，濃度為3 lnM的納米金溶液。 本發明中所用的寡核苷酸序列為10個胸腺嘧啶的單鏈寡核苷酸。其一端被巰基 所修飾，用於連接到納米金表面。 步驟取280uL 10 4M巰基修飾的特異性寡核苷酸，緩慢加入到60. 0mL納米金溶 液(粒徑13線濃度4. 67nM ;Au與DM的摩爾比為1 : 100)中，孵育16小時，然後加入 90. OmL緩衝溶液(lOml PBS， pH7. 4， 0. 1M NaCl， 10—4ML_半胱氨酸),繼續孵育40小時。離 心去上清，利用緩衝溶液(10ml PBS，O. l麗aCl)清洗兩遍，濃縮，得到納米金寡核苷酸探針。 向lOuL納米金寡核苷酸探針溶液中加入20uL濃度為10 3 10 7M的PBS(含0. 3M NaCl) 溶解的三聚氰胺溶液，混合均勻，加熱到95。C反應5min後，緩慢降到室溫。同時以不加三聚 氰胺溶液一組，加入牛奶中可能存在的幹擾離子的若干組作為對照。然後分別在上述溶液 中加入400uL去離子水，通過目視比色法觀測或紫外吸收光譜進行檢測。
結果根據圖1所示的原理和操作步驟，紫外吸收光譜圖見圖2A，圖2B為工作曲線，採用在520nm處和700nm處的吸光度差值進行表徵，圖2C為對應的目視比色法觀察結 果，圖2D為對牛奶樣品中可能共存的千擾離子實驗結果。可見三聚氰胺能夠與納米金寡核 苷酸探針特異性結合，引起納米金分散狀態的改變。隨三聚氰胺濃度變化,無論是直接目視 比色法觀察，還是藉助紫外可見分光光度計都能實現對樣品中三聚氰胺的檢測，檢出限為 46. 5nM,能夠達到國標要求，線性範圍4. 65X10—7 4. 65X 10—4，線性相關係數0. 9890。本 發明實用性強，能夠有效避免實際樣品中可能共存物質對三聚氰胺檢測的千擾，容許共存 倍數達幾千倍甚至上萬倍。
權利要求
一種基於寡核苷酸修飾的納米金檢測三聚氰胺的方法，其步驟是1)將能與三聚氰胺特異性結合的寡核苷酸連接到納米金表面形成捕獲探針，所述的納米金的粒徑為10～20nm，納米金溶液的反應濃度為1～100nM，反應溫度為10～38℃，反應時間為50～60小時，所述的納米金與寡核苷酸的濃度比為1∶50～1∶150，所述的含巰基的寡核苷酸修飾納米金反應體系中，加入緩衝溶液，該緩衝溶液為PBS或Tris-乙酸，反應濃度為10～20mM，同時加入NaCl寡核苷酸對納米金的修飾，反應濃度為0.1～1.0M，反應過程中引入1μM～1mM半胱氨酸或穀胱甘肽；2)為向步驟1)的寡核苷酸修飾的納米金探針溶液中加入待測溶液進行反應，其中，所述的待測溶液的反應濃度為10-3～10-7M，反應溫度為70～100℃，反應時間為3～7分鐘，所用緩衝溶液為Tris或PBS，或胂酸鹽緩衝溶液，反應濃度為1～100mM，同時加入NaCl以三聚氰胺與寡核苷酸的結合；3)為將步驟2)的反應液進行冷卻稀釋，通過目視比色法或測定紫外可見吸收光譜對三聚氰胺的檢測。
2. 根據權利要求1所述的--種基於寡核苷酸修飾的納米金檢測三聚氰胺的方法，其特 徵在於，所述的寡核苷酸為巰基修飾的寡核苷酸，該寡核苷酸的鹼基能夠與三聚氰胺特異 性結合。
3. 根據權利要求1所述的一種基於寡核苷酸修飾的納米金檢測三聚氰胺的方法,其特 徵在於，步驟1)所述的巰基修飾的寡核苷酸含有胸腺嘧啶，鹼基總數為2 IOO，胸腺嘧啶 個數為2 100。
全文摘要
本發明公開了一種基於寡核苷酸修飾的納米金檢測三聚氰胺的方法，其步驟1)將能與三聚氰胺特異性結合的寡核苷酸連接到納米金表面形成捕獲探針，納米金為一定粒徑、納米金溶液、反應溫度、反應時間，納米金與寡核苷酸的一定濃度比，加入NaCl寡核苷酸對納米金的修飾，反應過程中引入半胱氨酸或穀胱甘肽；2)向步驟1)的寡核苷酸修飾的納米金探針溶液中加入待測溶液反應，待測溶液的一定反應濃度、反應溫度、反應時間，加入NaCl以三聚氰胺與寡核苷酸的結合；3)將步驟2)的反應液進行冷卻稀釋，通過目視比色法或測定紫外可見吸收光譜對三聚氰胺的檢測。本發明操作簡便，利於推廣，能夠實現三聚氰胺的快速、靈敏、選擇性檢測。
文檔編號G01N21/31GK101701259SQ20091027245
公開日2010年5月5日 申請日期2009年10月20日 優先權日2009年10月20日
發明者何治柯, 李麗, 黃暉 申請人:武漢大學