菲律賓蛤仔基因組DNA的提取方法與流程
2023-04-23 15:43:06 2
本發明涉及菲律賓蛤仔基因組DNA的提取方法。
背景技術：
菲律賓蛤仔通常又稱雜色蛤，是貝殼類海產品，隸屬海洋無脊椎動物中的軟體動物門，雙殼綱，簾蛤目，簾蛤科，中文名名菲律賓蛤仔（Ruditapes philippinarum），南方俗稱花蛤(huage)，遼寧稱蜆子(xianzi)，山東稱蛤蜊(gala)，英文名：short necked clam。花蛤廣泛分布在我國南北海區，它生長迅速，養殖周期短，適應性強（廣溫、廣鹽、廣分布），離水存活時間長，是一種適合於人工高密度養殖的優良貝類，是我國四大養殖貝類之一。
分子生物學是生物學研究的一項重要分支，而DNA的提取則是分子生物學研究的重要基礎，DNA純度的純度及質量對後續的研究工作具有極為重要的影響。每一物種由於其自身各成分的含量不同（比如有的物種蛋白含量高、有的物種糖分含量高），會對DNA的純度和質量產生較大影響。因此，需要針對不同的物種開發出適宜的有針對性的提取方法。
技術實現要素：
針對上述問題，本發明旨在提供一種適於菲律賓蛤仔的高質量、高純度的DNA提取方法。
菲律賓蛤仔基因組DNA的提取方法，步驟如下：
（1）取菲律賓蛤仔肌肉組織3-8克，用液氮研磨後，將粉末平均加入到10-15管裝有500μL STE（100mM NaCl；10mM Tris-Cl，pH8.0；1mM EDTA，pH8.0）及50μL 10% SDS裂解緩衝液的1.5mL離心管中，隨即每管加入5μL 濃度為20mg/mL的蛋白酶K，55-57℃水浴10-60 min，至溶液澄清；
（2）每管加入250μL飽和酚、250μL氯仿/異戊醇（24:1），輕柔晃動5-15min，室溫10000-12000 rpm離心8-15min；
（3）離心後有機相位於下層，中間層為蛋白層，上層為溶有DNA的水相，吸取上清液至新離心管中，重複步驟（2），至水相和有機相之間無蛋白層殘留；
（4）吸取上清液至新離心管中，加入500μL氯仿/異戊醇，輕柔晃動5-15min，室溫10000-12000 rpm離心8-15min；
（5）吸取上清液，加入50μL 3M NaAc，緩慢輕柔搖勻，添加1mL在-20℃預冷的無水乙醇，放置於-20℃冰箱 20-50min，10000-15000rpm 離心8-15min，得到DNA沉澱；
（6）用預冷的 70%乙醇洗滌沉澱1-3次；
（7）沉澱乾燥，根據沉澱量多少加入不同量的無菌超純水及終濃度為0.05mg/mL的RNase A，37℃水浴15-40min，直至RNA全部溶解；
（8）用分光光度計測定DNA的濃度，同時進行瓊脂糖電泳檢測。
本發明的方法針對性強，特別適於菲律賓蛤仔DNA的提取，提取的DNA濃度、純度非常高，非常適於文庫構建、PCR等後續研究。
附圖說明
圖1 本發明方法提取的菲律賓蛤仔DNA的電泳圖。
具體實施方式
下面結合具體實施例對本發明做進一步詳細說明。
從市場購買的菲律賓蛤仔在實驗室用無菌海水暫養3-5天後，開始DNA的提取工作，步驟如下：
（1）取菲律賓蛤仔肌肉組織3-8克，用液氮研磨後，將粉末平均加入到10-15管裝有500μL STE（100mM NaCl；10mM Tris-Cl，pH8.0；1mM EDTA，pH8.0）及50μL 10% SDS裂解緩衝液的1.5mL離心管中，隨即每管加入5μL 濃度為20mg/mL的蛋白酶K，55-57℃水浴10-60 min，至溶液澄清；
（2）每管加入250μL飽和酚、250μL氯仿/異戊醇（24:1），輕柔晃動5-15min，室溫10000-12000 rpm離心8-15min；
（3）離心後有機相位於下層，中間層為蛋白層，上層為溶有DNA的水相，吸取上清液至新離心管中，重複步驟（2），至水相和有機相之間無蛋白層殘留；
（4）吸取上清液至新離心管中，加入500μL氯仿/異戊醇，輕柔晃動5-15min，室溫10000-12000 rpm離心8-15min；
（5）吸取上清液，加入50μL 3M NaAc，緩慢輕柔搖勻，添加1mL在-20℃預冷的無水乙醇，放置於-20℃冰箱 20-50min，10000-15000rpm 離心8-15min，得到DNA沉澱；
（6）用預冷的 70%乙醇洗滌沉澱1-3次；
（7）沉澱乾燥，根據沉澱量多少加入不同量的無菌超純水及終濃度為0.05mg/mL的RNase A，37℃水浴15-40min，直至RNA全部溶解；
（8）用分光光度計測定DNA的濃度，同時進行瓊脂糖電泳檢測。
經檢測，DNA的濃度為955 ng/uL，A260/A280=1.8。電泳結果如圖1所示，可見DNA的濃度及純度都非常高。