靶向沉默MyoⅩ的序列製備及其載體的構建的製作方法
2023-04-24 00:00:06
專利名稱：靶向沉默MyoⅩ的序列製備及其載體的構建的製作方法
靶向沉默Myo X的序列製備及其載體的構建技術領域
本發明屬於生物工程中的DNA重組技術領域，具體涉及特異性沉默靶標蛋Myo X 的序列設計合成及其表達載體構建。
技術背景肌球蛋白X (Myosin X，Myo X)是1994年於牛蛙的內耳中首次發現的，屬於非傳統型肌球蛋白家族，是細胞內重要的分子馬達，在神經系統發育中調節神經突起的生長。Myo X分子由頭部、頸部和尾部三部分組成。頭部區是馬達結構域，具有磷酸水解酶活性；頸部區具有三個IQ結構域，是Myo X與類鈣調蛋白(CLP)相互作用的部位；尾部區包括一個能使兩分子Myo X形成二聚體的鉸鏈結構域、三個能切割鈣蛋白酶的PEST結構域、三個能與 PIP3結合的PH結構域、一個能與微管結合的MyTH4和一個能結合β整合素(β-integrin) 的FERM結構域。
自發現以來，Myo X被廣泛的研究，近年來的研究表明，Myo X參與絲足的形成、 延伸和穩定，對絲足內物質的運輸起著非常重要的作用，在乳腺癌的發生發展過程中，Myo X的高表達預示著腫瘤具有強的轉移潛能，所以特異性的沉默Myo X至關重要。發明內容
本發明的目的是合成特定的能夠靶向沉默Myo X的特異鹼基序列，為更加深入的研究Myo X以及Myo X在選擇、製備治療腫瘤藥物中的作用提供了有效的手段。
本發明中所需要構建的主要是Myo X的沉默表達載體。核心沉默表達載體構建分為兩個大的步驟，首先是根據人源的Myo X序列設計出19bp的目的片段，合成的目的片段兩端帶有合適的酶切位點，將目的片段連接到pEN-h-siRNA載體上，連接轉化，挑取陽性克隆鑑定。鑑定正確後，用pEN-h-siRNA-Myo X和pDSL_hpGIP進行LR重組反應，這兩個載體重組後形成核心的沉默表達載體，轉化，挑取陽性克隆鑑定，陽性克隆酶切鑑定測序正確，進行沉默效率的檢測。
本發明中設計合成了能夠靶向人源Myo X的19bp的目的片段，片段序列為 cctcctagcc cttatcaat能夠特異性沉默Myo X的表達載體的構建包括以下步驟第一步，序列設計根據人源Myo X基因序列在Invitrogen公司主頁上用相應的軟體設計特異性識別Myo X的序列。
第二步，表達載體pEN_hHl-Myo X的構建將表達載體pEN_hHl雙酶切後，利用回收試劑盒回收線性化載體。經連接、轉化、 提取等步驟獲得重組的表達載體。酶切鑑定重組體，並且測序進一步確定。
第三步，LR重組構建Myo X -shRNA質粒抽提試劑盒抽提pDSL_hpUGIP和pEN_hHl_Myo X質粒,經重組、轉化、提取等步驟獲得重組的載體。酶切鑑定重組體，並且測序進一步確定。
第四步，沉默靶蛋白效率的檢測經轉染細胞後提取蛋白，利用western blot等試驗手段檢測沉默效率。
圖I為特異性沉默靶蛋白My0 X的序列的合成凝膠電泳圖；圖2為pEN_hHl表達載體BamH I和Xhol雙酶切電泳圖；圖3為pEN_hHl表達載體BamH I和Xhol雙酶切回收電泳圖；圖4為LR重組構建Myo X -shRNA測序結果；圖5為利用RT-PCR檢測，轉入Myo X-shRNA後Myo X表達量明顯降低，GAPDH為內參； 圖6為圖5結果的統計圖，對5次獨立實驗結果分析，沉默效率為51. 5%，進行t檢驗 p〈0. 01差異極顯著；圖7為Western blot免疫印跡分析，轉入Myo X siRNA沉默載體後Myo X表達量降低 70%ο
本發明中設計合成的19bp的目的片段，能夠特異性的沉默Myo X，同時也為構建Myo X-shRNA提供關鍵的序列片段。Myo X是一種非傳統的肌球蛋白，經研究表明，Myo X在腫瘤的形成和轉移過程中發揮一定的作用，構建成功的載體，能夠用來特異性的沉默Myo X，沉默Myo X能夠降低腫瘤的轉移潛能，所以能夠為選擇、製備治療腫瘤藥物提供了理論基礎。
具體實施例方式實施例一特異性沉默祀標蛋白Myo X的表達載體構建I、特異性沉默靶蛋白Myo X的序列設計(I)根據人源Myo X基因序列在Invitrogen公司主頁上用相應的軟體設計，設計的原則19bp的特異性結合Myo X的序列的GC含量為45%_55%，退火溫度45°C _65°C，同時避免起始端有兩個以上的A，尾端不能有兩個以上的T。將選取的片段進行BLAST人基因組比對，選擇特異性序列。
(2)以 BamH I - N19-TT_loop- N』 19-Xhol 形式合成一段 60bp 序列，N』 19 為 N19的反向互補，5』端為BamH I酶切位點，3』端為Xhol酶切位點。設計合成的片段分別靶向 Myo X 的 cDNA 序列 1971- 1989 (Myo XshRNA I)和 3299 -3317 (Myo XshRNA 2)， Scramble shRNA 非特異靶向片段為 GTGAGATCGTAGTGCGTGA。
2、特異性沉默靶蛋白Myo X的序列的合成與儲存圖I(I)將合成的兩段olig溶解至50 μΜ，各取ΙΟΟμΙ混合。
(2)95 °C變性5min，快速轉移至70 1水浴鍋中，孵育lOmin，關閉水浴鍋電源，過夜。
(3)次日取出混勻，放在冰上備用，或者-20 °C長期保存。
3、表達載體pEN_hHl_Myo X的構建(I)取Mg pEN_hHl載體，BamH I和Xhol雙酶切，電泳，回收線性pEN_hHl大片段圖 2圖3。
(2)連接和轉化。將線性pEN_hHl濃度稀釋至160ng/>，連接反應(NEB公司的T4 DNA連接酶)權利要求
1.能夠靶向沉默MyoX的特異鹼基序列，其特徵是其序列為cctcctagcc cttatcaat。
2.按照權利要求I所述的能夠靶向沉默MyoX的特異鹼基序列在選擇、製備治療腫瘤藥物中的作用。
全文摘要
本發明屬於生物工程中的DNA重組技術領域,具體涉及特異性沉默靶標蛋MyoⅩ的序列設計合成、表達載體構建及其應用。本發明通過根據人源的MyoⅩ序列設計出19bp的目的片段，合成的目的片段兩端帶有合適的酶切位點，將目的片段連接到pEN-h-siRNA載體上，連接轉化，挑取鑑定，重組反應等形成核心的沉默表達載體，能夠特異性的沉默MyoⅩ，同時也為構建MyoⅩ-shRNA提供關鍵的序列片段，從而為選擇、製備治療腫瘤藥物提供了基礎。
文檔編號C12N15/113GK102925443SQ20121043024
公開日2013年2月13日 申請日期2012年11月1日 優先權日2012年11月1日
發明者朱筱娟, 曹讓娟, 陳晶瀅, 卿旭, 翟豔華, 俞華莉 申請人:東北師範大學