一種檢測番茄幼苗攜帶番茄黃化曲葉病毒試劑盒及方法
2023-04-24 01:09:01 1
專利名稱：一種檢測番茄幼苗攜帶番茄黃化曲葉病毒試劑盒及方法
技術領域：
本發明涉及生物技術領域，尤其涉及一種檢測番茄幼苗攜帶番茄黃化曲葉病毒試劑盒及方法。
背景技術：
番爺黃化曲葉病毒(Tomato yellow leaf curl virus,TYLCV)是引起番爺生產上一種毀滅性病害「番茄黃化曲葉病毒病」的重要毒源，已給我國的番茄生產造成了嚴重的經濟損失。生產中，帶毒番茄幼苗不僅造成絕產，而且是造成病害快速傳播擴散的重要源頭，使用無毒番茄幼苗和及時快速地對番茄幼苗進行檢測是綜合控制該病害的關鍵措施，但番茄幼苗被病毒侵染後到表現症狀有14-30天的潛伏期，這個特點給病害的診斷和控制造成困難和問題，在番茄幼苗移栽過程中不能分辨健康苗和帶毒苗，容易造成帶毒苗進入生產 溫室和大棚，使得後續病害大範圍快速擴散。為此，必須發明一種簡單、快速、靈敏的檢測方法用於番茄幼苗移栽前是否攜帶TYLCV的檢測。目前檢測TYLCV常見的有2種方法，一是分子生物學檢測方法，主要是利用PCR方法，但PCR檢測耗時，產物不便檢測，操作繁瑣，反應需要PCR儀和特殊試劑，不適於生產一線使用。二是血清學檢測方法，主要是ELISA方法，但ELISA的檢測靈敏度上以及特異性不高，不適於快速準確檢測。現有技術的不足主要有一是使用的引物不適於我國發生的TYLCV的檢測，致使檢測效率低，假陰性率高；二是沒有適用番茄幼苗檢測的方法；三是沒有明確提出取樣部位和取樣方法；四是需製備DNA，過程比較複雜，不易推廣應用。近幾年逐漸發展起來的環介導恆溫擴增技術(Loop mediated isothermal amplification, LAMP)以快速高效、簡便易行、靈敏特異等優勢正在被用於病原微生物的檢測工作中。
發明內容
本發明的一個目的是提供一種檢測番茄黃化曲葉病毒的環介導等溫擴增引物組。本發明提供的引物組，包括引物I、引物2、引物3和引物4 ；所述引物I、所述引物2、所述引物3和所述引物4的核苷酸序列分別依次為序列表中的序列I、序列2、序列3和序列4。上述引物組由引物I、引物2、引物3和引物4組成，所述引物I、所述引物2、所述引物3、所述引物4的摩爾比具體為I :1 8 :8。本發明的另一個目的是提供一種檢測番茄黃化曲葉病毒的環介導等溫擴增試劑。本發明提供的環介導等溫擴增試劑，包括上述的引物組、環介導等溫擴增緩衝液、dNTPs、硫酸鎂、甜菜鹼和水。上述環介導等溫擴增試劑還包括DNA聚合酶，所述環介導等溫擴增試劑由上述的引物組、環介導等溫擴增緩衝液、dNTPs、硫酸鎂、DNA聚合酶、甜菜鹼和水組成；所述引物I和所述引物2在所述環介導等溫擴增試劑中的終濃度均具體為0. 2 u mol/L,所述引物3和所述引物4在所述環介導等溫擴增試劑中的終濃度均具體為L 6 y mol/L。本發明的第三個目的是提供一種檢測番茄黃化曲葉病毒的環介導等溫擴增試劑盒。本發明提供的試劑盒，包括上述的引物組或上述的環介導等溫擴增試劑。上述的引物組、上述環介導等溫擴增試劑或上述試劑盒在製備檢測和/或輔助檢測待測番茄幼苗中是否攜帶番茄黃化曲葉病毒產品或在檢測和/或輔助檢測待測番茄幼苗中是否攜帶番茄黃化曲葉病毒中的應用也是本發明保護的範圍。本發明的第四個目的是提供一種製備對待測番茄幼苗進行環介導恆溫擴增反應的模板的方法。
本發明提供的方法，包括如下步驟用普通牙籤或實驗室用普通微量液體吸頭穿刺待檢番茄葉片或葉柄，然後將牙籤或吸頭直接在環介導恆溫擴增反應體系中輕輕攪拌即完成樣品製備。該取樣方法為直接用牙籤或吸頭，其具有簡潔、快速、極低成本的特點。本發明的第五個目的是提供一種檢測和/或輔助檢測待測番茄幼苗中是否攜帶番茄黃化曲葉病毒的方法。本發明提供的方法，包括如下步驟用上述環介導等溫擴增試劑對待測番茄幼苗進行環介導恆溫擴增反應，檢測環介導恆溫擴增反應產物，確定待測番茄幼苗中是否攜帶番爺黃化曲葉病毒。上述方法中，所述檢測環介導恆溫擴增反應產物的方法為如下I)或2):I)將所述環介導恆溫擴增反應產物中加入染色劑反應，得到染色後反應產物；若染色後反應產物的顏色為綠色，則待測番茄幼苗攜帶或候選攜帶番茄黃化曲葉病毒，若染色後反應產物的顏色為橙色，則待測番茄幼苗不攜帶或候選不攜帶番茄黃化曲葉病毒；2)將所述環介導恆溫擴增反應產物電泳，若反應產物呈典型的連續梯狀條帶，則說明待測番茄幼苗攜帶或候選攜帶番茄黃化曲葉病毒，若反應產物無典型的連續梯狀條帶，則說明待測番茄幼苗不攜帶或候選不攜帶番茄黃化曲葉病毒。上述染色劑為SYBR Green I，加入染色劑反應時間為5min。上述方法中，用上述環介導等溫擴增試劑對待測番茄幼苗進行環介導恆溫擴增反應的方法包括如下步驟I)用尖端物直接穿刺待測番茄幼苗組織；2)將經步驟I)處理後所述尖端物的用於刺穿待測番茄幼苗組織的一端放入上述環介導等溫擴增試劑中攪拌，去除所述尖端物，得到反應液；3)向步驟2)得到的反應液中添加DNA聚合酶，使其在所述反應液中的終濃度為0. 32U/ u L ;反應，得到環介導恆溫擴增產物。上述步驟I)中的尖端物為牙籤或吸頭。上述方法中，所述環介導等溫擴增反應的溫度為63°C _65°C，所述環介導等溫擴增反應的時間為45分鐘-60分鐘。上述方法中，所述待測番茄苗組織為葉片或葉柄；所述葉片具體為所述待測番茄幼苗頂端數第2片葉片；所述葉柄具體為所述待測番茄幼苗頂端數第2片葉的葉柄。上述待測番茄幼苗為7周齡待測番茄幼苗。本發明的實驗證明，本發明針對番茄幼苗，首先根據我國發生的TYLCV優勢株系的基因組序列設計LAMP引物，通過實驗提出了取樣部位和取樣方法，直接利用牙籤或吸頭穿刺葉片，不需提取DNA，直接進行LAMP反應，具有簡便、快速、靈敏等優勢，克服了傳統技術中耗時、提取核酸、儀器要求高、步驟繁瑣等缺點，為番茄幼苗攜帶番茄黃化曲葉病毒的檢測提供了一種便於推廣應用的檢測方法。
圖I為LAMP反應檢測感染番茄黃化曲葉病毒番茄幼苗的結果圖2為常規方法檢測感染番茄黃化曲葉病毒番茄幼苗的結果
具體實施例方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。
下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。下述實施例中番茄黃化曲葉病毒記載在如下文章中北京地區番茄黃化曲葉病毒病的鑑定及防治對策討論，周濤，師迎春，陳笑瑜，範在豐，植物保護，2010年第2期，公眾可從中國農業大學、北京市植物保護站獲得。實施例I、檢測番茄幼苗攜帶番茄黃化曲葉病毒的試劑盒製備I、引物的設計根據我國發生的番茄黃化曲葉病毒優勢株系的核酸序列設計引物，引物序列如下TYLCV-C-F3: 5，-AACGCCATTCTCTGCTTGA-3』(序列 I)TYLCV-C-B3: 5，-GAGCCACTGTTCGCAAGT-3，(序列 2 ) TYLCV-C-FIP: 5，-ACTACCTCCACATCAACTGCAAGGAGCAGTGATGAGTTCCC-3，(序列 3 )TYLCV-C-BIP: 5，-ATGAGCAGCCACAGTCTAGGTGGTTCAACACAAGATAGCCA-3』(序列 4)2、番茄黃化曲葉病毒檢測反應液及試劑盒的製備反應液為24 u L，其中加入的引物及終濃度分別為TYLCV-C-F3和TYLCV-C-B3各為0. 2u mol/L ；TYLCV-C-FIP和TYLCV-C-BIP各為I. 6 y mol/L ;其他成分及終濃度分別為甜菜喊 5mol/L ；dNTPslOmmol/L ； I 倍的 Thermopol buffer (含 MgSO4 2mmol/L, New EnglandBiolabs Inc,目錄號 B9004S) ；MgS04 50mmol/L 和水。番茄黃化曲葉病毒檢測試劑盒包括4條引物或上述反應液。實施例2、檢測番茄幼苗攜帶番茄黃化曲葉病毒的試劑盒的應用一、檢測番茄幼苗攜帶番茄黃化曲葉病毒的試劑盒的LAMP反應I、取樣及LAMP反應在育苗盤內隨機取7周齡(3-4片葉)的編號1-3感染病毒番茄幼苗(且葉片黃化、捲曲、植株矮化)和編號4不感染病毒的番茄幼苗(無葉片黃化、捲曲、植株矮化等症狀)，用牙籤(也可以用吸頭)直接穿刺番茄幼苗頂端數第2片葉片(也可以為頂端數第2片葉的葉柄)，然後將牙籤放入裝有上述一的2的反應液的小管內，輕輕攪拌3次，將牙籤取出後，再分別向管中補充Bst DNA聚合酶(8~111)1111，共計25111反應體系。總體系為25 ii L，其中 Bst DNA 聚合酶 I y L (終濃度為 0. 32U/ u L, New EnglandBiolabs Inc,目錄號M0275S)，加入的引物及終濃度分別為TYLCV-C-F3和TYLCV-C-B3各為0. 2u mol/L ；TYLCV-C-FIP和TYLCV-C-BIP各為I. 6 y mol/L ;其他成分及終濃度分別為甜菜喊5mol/L、dNTPsl0mmol/L、I 倍的 Thermopol buffer (含MgSO4 2mmol/L) >MgSO4 50mmoI /L和水。反應條件63°C恆溫水浴鍋反應45min，得到LAMP產物。2、鑑定I)直接用肉眼觀察顏色變化加螢光染料直接判別結果反應結束後，將上述LAMP產物放置冰上(0°C) 10分鐘，短暫離心後向產物中加入I U I SYBR Green I (Invitrog en, S7563,按體積比1:10000稀釋使用)，5min後觀察結果。若反應管顏色為綠色，則說明待測番茄幼苗攜帶或候選攜帶番茄黃化曲葉病毒，若反應管顏色為橙色，則說明待測番茄幼苗不攜帶或候選不攜帶番茄黃化曲葉病毒；結果如圖IA所示，從左到右依次為編號1-3感染病毒番茄幼苗、編號4不感染病毒番茄幼苗、空白對照，可以看出，編號為1-3的感染病毒番茄幼苗反應管顏色為綠色，說明攜帶番茄黃化曲葉病毒；編號為4的不感染病毒番茄幼苗反應管顏色為橙色，說明不攜帶番茄黃化曲葉病毒。2)電泳檢測分別取5 U L LAMP產物經2 %瓊脂糖凝膠在0. 5 X TBE緩衝液和160V電壓條件下電泳30min，在0. g/mL的溴化乙錠(EB)中染色lOmin，染色後於凝膠成像系統中觀察。若反應產物有明亮的呈彌散狀的核酸泳帶且呈典型的連續梯狀，則說明待測煙粉蝨攜帶或候選攜帶番茄黃化曲葉病毒，若反應產物無明亮的呈彌散狀的核酸泳帶且呈典型的連續梯狀，則說明待測煙粉蝨不攜帶或候選不攜帶番茄黃化曲葉病毒；結果如圖IB所不，1-5依次為編號1-3感染病毒番爺幼苗、編號4不感染病毒番爺幼苗、空白對照，可以看出，編號為1-3的番茄幼苗反應產物呈典型的連續梯狀泳帶，說明攜帶番茄黃化曲葉病毒;編號為4的番茄幼苗反應產物不呈典型的連續梯狀泳帶，說明不攜帶番茄黃化曲葉病毒。二、常規檢測將編號1-3感染病毒番茄幼苗和編號4不感染病毒的番茄幼苗進行如下檢測，參照Lefeuvre P, Hoareau M, Delatte H, Reynaud B，Lett J-M(2007)A multiplex PCR methoddiscriminating between the TYLCV and TYLCV-Mld clades of Tomato yellow leafcurl virus. J. Virol. Methodsl44:165-168 的方法,具體步驟如下I、葉片總DNA的提取將上述LAMP方法中穿刺過的編號1-3感染病毒番茄幼苗和編號4不感染病毒的番茄幼苗，利用CTAB方法快速提取番茄葉片總DNA ;具體如下取0. Ig番茄葉片樣品，液氮中充分研磨，轉入2ml離心管後，加入65°C預熱的600ii L2%CTAB抽提緩衝液(2% CTAB,200mM Tris-HCl，140mM NaCl,40mM EDTA，I % PVP，pH8. 0)，混勻後於 65°C溫育 30min，再用600 u L氯仿抽提兩次後，上清液中加入等體積的異丙醇，取沉澱經70 %乙醇洗滌，乾燥後溶於TE中，於-20°C保存。2、PCR擴增、克隆和序列測定根據Lefeuvre et al. (2007)報導的檢測番茄黃化曲葉病毒的多重PCR引物 TYLCV-1840F :5 ' -GGTCTACGTCATCAATGAC-3 '(基因組上的位置 1840-1858)；Mld-2354R 5 ' -AGGGAGCTAAATCCAGTT-3 '(基因組上的位置 2354-2367) ;IL_2642R 5' -ACACCGATTCATTTCAAC-3'(基因組上的位置 2642-2659)進行 PCR 擴增。建立25 ii L PCR反應體系番茄葉片總DNA0. 5 U L,反應的終濃度為PCR反應緩衝液 I X，d NTPsO. 2mM、TYLCV-1840FI u M、Mld_2354R 0. 5 u M, IL-2642R 2 u M, Taq DNAPolymerase I. 25U, ddH20 18.75 U L。PCR反應條件94°C變性2min，按下列條件進行32個循環(94°C變性30S，58°C復性30S，72°C延伸30S)，72°C延伸lOmin。全部PCR產物經I %瓊脂糖凝膠電泳分離，染色後觀察條帶位置。經電泳凝膠成像儀拍照後，結果如圖2所示，1-5依次為編號1-3感染病毒番茄幼苗、編號4不感染病毒番茄幼苗、空白對照，可以看出，僅編號1-3感染病毒番茄幼苗出現SOObp左右的目標條帶，對目標條帶進行克隆測序(序列如下序列5)，經比對分析此片段與 番茄黃化曲葉病毒GenBank中登錄號JQ038238. I的第1829-2633位核苷酸完全一致，說明1-3樣品被番茄黃化曲葉病毒感染。從上述結果可以看出本發明的引物和方法正確。
權利要求
1.檢測番茄黃化曲葉病毒的環介導等溫擴增引物組，包括引物I、引物2、引物3和引物4 ； 所述引物I、所述引物2、所述引物3和所述引物4的核苷酸序列分別依次為序列表中的序列I、序列2、序列3和序列4。
2.根據權利要求I所述的引物組，其特徵在於所述引物組由引物I、引物2、引物3和引物4組成；所述引物I、所述引物2、所述引物3、所述引物4的摩爾比為I :1 8 :8。
3.檢測番茄黃化曲葉病毒的環介導等溫擴增試劑，包括權利要求I或2所述的引物組、 環介導等溫擴增緩衝液、dNTPs、硫酸鎂、甜菜鹼和水。
4.根據權利要求3所述的環介導等溫擴增試劑，其特徵在於所述環介導等溫擴增試劑還包括DNA聚合酶，所述環介導等溫擴增試劑由權利要求I或2所述的引物組、環介導等溫擴增緩衝液、dNTPs、硫酸鎂、DNA聚合酶、甜菜鹼和水組成； 所述引物I和所述引物2在所述環介導等溫擴增試劑中的終濃度均為O. 2 μ mol/L, 所述引物3和所述引物4在所述環介導等溫擴增試劑中的終濃度均為I. 6 μ mol/L。
5.檢測番茄黃化曲葉病毒的環介導等溫擴增試劑盒，包括權利要求I或2所述的引物組或權利要求3或4所述的環介導等溫擴增試劑。
6.權利要求I或2所述的引物組、權利要求3或4所述環介導等溫擴增試劑、權利要求5所述試劑盒在製備檢測和/或輔助檢測待測番茄幼苗中是否攜帶番茄黃化曲葉病毒產品或在檢測和/或輔助檢測待測番茄幼苗中是否攜帶番茄黃化曲葉病毒中的應用。
7.—種檢測和/或輔助檢測待測番茄幼苗中是否攜帶番茄黃化曲葉病毒的方法，包括如下步驟用權利要求3或4所述環介導等溫擴增試劑對待測番茄幼苗進行環介導恆溫擴增反應，檢測環介導恆溫擴增反應產物，確定待測番茄幼苗中是否攜帶番茄黃化曲葉病毒。
8.根據權利要求7所述的方法，其特徵在於 所述檢測環介導恆溫擴增反應產物的方法為如下I)或2): 1)將所述環介導恆溫擴增反應產物中加入染色劑反應，得到染色後反應產物；若染色後反應產物的顏色為綠色，則待測番茄幼苗攜帶或候選攜帶番茄黃化曲葉病毒，若染色後反應產物的顏色為橙色，則待測番茄幼苗不攜帶或候選不攜帶番茄黃化曲葉病毒； 2)將所述環介導恆溫擴增反應產物電泳，若反應產物呈典型的連續梯狀條帶，則說明待測番茄幼苗攜帶或候選攜帶番茄黃化曲葉病毒，若反應產物無典型的連續梯狀條帶，則說明待測番茄幼苗不攜帶或候選不攜帶番茄黃化曲葉病毒。
9.根據權利要求7或8所述的方法，其特徵在於 所述用權利要求3或4所述環介導等溫擴增試劑對待測番茄幼苗進行環介導恆溫擴增反應的方法包括如下步驟 1)用尖端物直接穿刺待測番茄幼苗的組織； 2)將經步驟I)處理後所述尖端物的用於刺穿待測番茄幼苗組織的一端放入權利要求3所述環介導等溫擴增試劑中攪拌，得到反應液； 3)向步驟2)得到的反應液中添加DNA聚合酶，使其在所述反應液中的終濃度為O.32U/μ L ;反應，得到環介導恆溫擴增產物。
10.根據權利要求7-9中任一所述的方法，其特徵在於所述環介導等溫擴增反應的溫度為63°C _65°C，所述環介導等溫擴增反應的時間為45分鐘-60分鐘；所述待測番茄苗組織為葉片或葉柄；所述葉片具體為所述待測番茄幼苗 頂端數第2片葉片；所述葉柄具體為所述待測番茄幼苗頂端數第2片葉的葉柄。
全文摘要
本發明公開了一種檢測番茄幼苗攜帶番茄黃化曲葉病毒試劑盒及方法。本發明提供的引物組，包括引物1、引物2、引物3和引物4；所述引物1、所述引物2、所述引物3和所述引物4的核苷酸序列分別依次為序列表中的序列1、序列2、序列3和序列4。本發明的實驗證明，本發明針對番茄幼苗是否被番茄黃化曲葉病毒侵染，根據我國發生的TYLCV優勢株系的基因組序列設計LAMP引物，通過實驗提出了直接利用牙籤或吸頭穿刺番茄葉片或葉柄，不需提取DNA，直接進行LAMP反應，具有簡便、快速、靈敏等優勢，克服了傳統技術中耗時、提取核酸、儀器要求高、步驟繁瑣等缺點。
文檔編號C12Q1/68GK102776295SQ201210274209
公開日2012年11月14日 申請日期2012年8月3日 優先權日2012年8月3日
發明者周濤, 師迎春, 梁彥, 範在豐, 鄭建秋 申請人:中國農業大學, 北京市植物保護站