肝癌幹細胞疫苗及其製備方法與應用的製作方法

2023-05-21 09:18:56

肝癌幹細胞疫苗及其製備方法與應用的製作方法
【專利摘要】本發明公開了一種腫瘤幹細胞疫苗及其製備和應用。本發明所述的肝癌幹細胞疫苗包括：按體積比為3:1:1混合的滅活的肝癌幹細胞、甘露聚糖肽和脂肪乳。本發明所述的肝癌幹細胞疫苗的製備方法，包括以下步驟：獲得肝癌幹細胞；將所述肝癌幹細胞滅活；以及將滅活的肝癌幹細胞凍融在生理鹽水裡，與佐劑甘露聚糖肽、脂肪乳混勻，從而獲得所述的肝癌幹細胞疫苗。本發明提供了根據本發明所述的製備方法獲得的肝癌幹細胞疫苗用於製備治療肝癌的藥物中的用途。本發明為肝癌的治療及其疫苗的製備提供了一種新的途徑，對肝癌患者具有積極地治療效果，可增強患者的免疫功能，對延長患者的生存時間具有積極作用。
【專利說明】肝癌幹細胞疫苗及其製備方法與應用

【技術領域】
[0001] 本發明涉及生物醫藥工程技術，涉及一種腫瘤幹細胞疫苗及其製備和應用。

【背景技術】
[0002] 惡性腫瘤是一種全身性的慢性疾病。在中晚期患者體內，不僅臟器中有影像學檢 查時明顯的團塊腫瘤,在外周血中更有大量看不見的循環腫瘤細胞和腫瘤幹細胞（Cancer stem cell，CSC)，隨時準備定居在機體易感部位，發育成新的轉移灶，這也是腫瘤無法根治 的原因。傳統的腫瘤治療包括4種主要療法，即手術、化療、放療和免疫治療。通常前三種療 法治療3-5年後，腫瘤都會發生周邊臟器或遠端臟器的轉移。隨著對CSC研究的深入，人們 已經明確復發和轉移的原因不是手術做得不徹底，而是由於缺乏有效的控制、甚至消滅CSC 的方法。
[0003] CSC來自人類自體幹細胞的惡變，具有低分化度和高擴增性等特點。這些幹細胞可 抵抗幾乎全部的傳統化療藥物及放療，可在傳統治療的同時即引起腫瘤肝復發和轉移。這 種現象對於很多免疫治療也不例外，原因是過去一直使用成熟腫瘤細胞作為抗原供免疫細 胞識別，而CSC不表達這些抗原，可逃避免疫攻擊。所以，腫瘤的免疫治療急需更新觀念，將 治療的主攻方向從成熟腫瘤細胞轉變為CSC。
[0004] 目前國際公認的成熟的尋找CSC的方法是利用ALDEFLUOR/ALDH在人類腫瘤中尋 找。ALDH是所有幹細胞中共有的一種酶，在腫瘤幹細胞中高或強表達，而在普通幹細胞中弱 或無表達。
[0005] 目前，為了獲得腫瘤幹細胞（CSC)，人們常通過大量培養普通的腫瘤細胞系，由單 瓶消化擴增至多瓶，再提取出其內的腫瘤幹細胞。採用這種方法，其存在很多弊端：獲取的 腫瘤幹細胞數量有限，普通腫瘤細胞培養花費的人力與財力頗大，長期大量培養各種腫瘤 細胞會需要很多培養試劑、配置專人、容易汙染致死，甚至出錯；腫瘤幹細胞培養存活率低； 培養普通腫瘤細胞因培養瓶或培養箱空間有限，獲得的細胞數量也就不多，從中再抽取腫 瘤幹細胞，得到的腫瘤幹細胞量就更少，遠無法滿足需求。因此，開發一種操作簡單、快捷的 有助於獲取高產量的腫瘤幹細胞（CSC)的製備方法也是非常有必要的。
[0006] 近年來，已經有關於腫瘤幹細胞疫苗具有抗腫瘤療效的報導，理論上滅活的腫瘤 幹細胞可被直接作為疫苗，但是臨床上的療效很不理想，因此有必要研究和開發適合於臨 床應用的腫瘤幹細胞疫苗。
[0007] 原發性肝癌（primary carcinoma of liver,以下簡稱肝癌）是我國常見的惡性 腫瘤之一。據20世紀90年代統計，我國肝癌的年死亡率為20. 37/10萬，在惡性腫瘤死亡 順位中佔第2位，在城市中僅次於肝癌；農村中僅次於胃癌。由於血清甲胎蛋白（AFP)的 臨床應用和各種影像學技術的進步，特別是AFP和超聲顯像用於肝癌高危人群的監測，使 肝癌能夠在無症狀和體徵的亞臨床期作出診斷，加之外科手術技術的成熟，以及各種局部 治療等非手術治療方法的發展，使肝癌的預後較過去有了明顯提高。傳統的治療肝癌的方 法是首選手術切除，但不是所有的肝癌患者都適合手術。只有心肝功能較好，肝臟腫瘤較局 限，沒有轉移條件的患者才適宜手術。加上我國肝癌患者多數有肝炎、肝硬化的病史，臨床 有80%左右的患者因各種原因不能手術。肝癌具有侵襲性和難治癒的特點，治療後仍有可 能復發或轉移。而其起源、復發與轉移的真正原因可能是存在於肝癌內極少數具有幹細胞 的自我更新能力和多向分化潛能的細胞群，即肝癌幹細胞，這些細胞具有化療、放療及缺氧 抵抗性，同時具有高致瘤性、高侵襲轉移性，在肝癌的發生、發展乃至轉移、復發中起著極 其重要作用。然而，放療和化療對存在於腫瘤中數量較少的幹細胞樣細胞群療效甚微，經過 治療後殘存的肝癌幹細胞的增殖足以促使肝癌復發和轉移之一。目前尚缺乏有效的肝癌幹 細胞疫苗，本領域技術人員在這方面亟待取得突破。


【發明內容】

[0008] 本發明的第一個方面是提供一種肝癌幹細胞疫苗，對肝癌患者具有積極地治療效 果，可增強患者的免疫功能。
[0009] 本發明所述的肝癌幹細胞疫苗包括：按體積比為3:1:1混合的滅活的肝癌幹細 胞、甘露聚糖肽和脂肪乳。
[0010] 本發明的第二個方面提供一種肝癌幹細胞疫苗的製備方法，可實現簡單、快捷地 獲取高產量、易於質量控制的肝癌幹細胞，並製備出臨床上有效的肝癌幹細胞疫苗。
[0011] 本發明所述的肝癌幹細胞疫苗的製備方法，包括以下步驟：獲得肝癌幹細胞；將 所述肝癌幹細胞滅活；將滅活的肝癌幹細胞凍融在生理鹽水裡，與佐劑甘露聚糖肽、脂肪乳 混勻，從而獲得所述的肝癌幹細胞疫苗。
[0012] 根據本發明所述的肝癌幹細胞疫苗的製備方法的進一步特徵，所述滅活包括：將 肝癌幹細胞由-80°c至20°C反覆凍融五次致死。
[0013] 根據本發明所述的肝癌幹細胞疫苗的製備方法的進一步特徵，所述肝癌幹細胞、 甘露聚糖肽和脂肪乳的混合比例為3:1:1 (體積比）。
[0014] 根據本發明所述的肝癌幹細胞疫苗的製備方法的進一步特徵，所述的肝癌幹細胞 是⑶133陽性肝癌幹細胞。
[0015] 根據本發明所述的肝癌幹細胞疫苗的製備方法的進一步特徵，所述的CD133陽性 肝癌幹細胞是通過以下步驟製備的：
[0016] A.將液氮或_80°C保存的肝癌細胞於37°C水浴，快速溶化；
[0017] B.用8. Oml的含10% FBS的RPMI1640培養基混勻已融化的肝癌細胞懸液，於1500 轉/分，離心8分鐘；
[0018] C.棄上清，再吸取8. Oml培養基質混勻細胞沉澱，再1500轉/分，離心8分鐘，棄 上清，細胞沉澱用I. Oml培養基混勻，備用；
[0019] D.另取一個75cm2方瓶，加入14. Oml培養基質，將I. Oml上述製備的含肝癌細胞 懸液加入此方瓶中，於37°C，5% CO2孵育箱中培養；
[0020] E.肝癌細胞呈貼壁生長，經過3-4天，肝癌細胞生長至80%-95%單層時，棄上清， 用0. 5mM的EDTA，處理肝癌細胞大約3-5分鐘，用倒置顯微鏡觀察，當90%的肝癌細胞變圓 時，即可用彎管吹打並將消化的細胞轉移到15ml離心管中，於1500轉/分下，離心8分鐘， 棄上清，計數，若細胞數不足，擴增至三個培養瓶，繼續消化離心；
[0021] F.加入緩衝液重懸細胞，採用⑶133免疫磁珠分選系統從細胞液中分選出⑶133 陽性肝癌幹細胞；
[0022] G.將前一步驟獲得的⑶133陽性肝癌幹細胞在DMEM/F12培養液中進行培養；
[0023] H. 37°C、5% CO2孵育箱中培養5-7天，從而獲得足夠用於製備肝癌幹細胞疫苗的 ⑶133陽性肝癌幹細胞。
[0024] 根據本發明所述的肝癌幹細胞疫苗的製備方法的進一步特徵，所述步驟E中，在 加入EDTA的同時加入0. 25%胰酶I. Oml以消化腫瘤細胞。
[0025] 根據本發明所述的肝癌幹細胞疫苗的製備方法的進一步特徵，所述步驟G中，在 DMEM/F12培養液中添加：生長因子rhEGF15?25ng/ml、rhbFGF5?15ng/ml、硫酸肝素2? 6ug/ml、胎牛血清0· 1?0· 2% (質量百分比）和青黴素-鏈黴素雙抗0· 5?L 5% (質量 百分比）。
[0026] 根據本發明所述的肝癌幹細胞疫苗的製備方法的進一步特徵，所述步驟H中， 所述足夠用於製備肝癌幹細胞疫苗的CD133陽性肝癌幹細胞是培養至細胞個數達到 IXlO5?5X105/ml的CD133陽性肝癌幹細胞。
[0027] 本發明的第三個方面提供了根據本發明所述的製備方法獲得的肝癌幹細胞疫苗 用於製備治療肝癌的藥物中的用途。
[0028] 本發明所述的肝癌幹細胞疫苗劑及其製備方法具有以下特點和優點：
[0029] (1)本發明所述的肝癌幹細胞疫苗中含有藥學上可接受的佐劑甘露聚糖肽，能誘 導體內潛在的DC，進而增強攝取抗原能力，提升機體免疫功能；提升機體外周白細胞，增強 機體防禦能力。
[0030] (2)本發明所述的肝癌幹細胞疫苗中含有藥學上可接受的佐劑脂肪乳，起到緩釋 作用，讓疫苗緩慢被吸收，延長疫苗作用的時間，增強療效。
[0031] (3)本發明所述的肝癌幹細胞疫苗中，肝癌幹細胞與佐劑甘露聚糖肽和脂肪乳的 比例關係是優選的結果，例如，當臨床皮下注射需求量為0. 5ml時，取肝癌幹細胞0. 3ml、甘 露聚糖肽和脂肪乳各〇. lml，然後混勻。這樣的比例能保證腫瘤幹細胞濃度適中，過濃會影 響吸收，過稀則影響藥效；同時0. 5ml的皮下注射量也在循證醫學允許的皮下注射範圍內 (皮下注射量小於Iml)。
[0032] (4)本發明將未老化的腫瘤細胞經過消化復甦培養、免疫磁珠分選來獲得單個的 CD133陽性腫瘤幹細胞CSC，具有操作簡便、易於質控、獲得的肝癌幹細胞陽性率高的特點。
[0033] (5)本發明為肝癌的治療及其疫苗的製備提供了一種新的途徑，本發明所述的疫 苗對肝癌患者具有積極地治療效果，可增強患者的免疫功能，對延長患者的生存時間具有 積極作用。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0034] 圖IA為本發明所述方法得到的肝癌幹細胞陽性率檢測結果。
[0035] 圖IB為採用現有方法製備肝癌幹細胞的陽性率檢測結果。
[0036] 圖2是採用本發明所述方法製備得到的肝癌幹細胞疫苗的治療組和對照組的生 存時間曲線圖。
[0037] 圖3為注射肝癌幹細胞疫苗後體液免疫應答的結果比較。

【具體實施方式】
[0038] 下面結合附圖和實施例對本發明的技術方案作進一步說明。
[0039] 本文中，所述的腫瘤細胞是指傳代2-3次的未老化腫瘤細胞。
[0040] 本文中所使用的所有專業與科學用語若未做特別說明，均與本領域技術人員所熟 悉的意義相同。本文中涉及的甘露聚糖肽及脂肪乳其獲得是通過正規醫院購買得到的， CD133免疫磁珠分選系統進行細胞分選的技術也是本【技術領域】的現有技術，具體可以採用 CD 133免疫磁珠分離試劑盒進行分選。
[0041] 實施例1 :肝癌幹細胞疫苗的製備
[0042] 本實施例是以液氮中儲存的肝癌細胞為原料來製備肝癌幹細胞疫苗。
[0043] 1.將液氮或-80°C保存的肝癌細胞QGY-7701於37°C水浴，快速溶化；
[0044] 2.用8. Oml培養基（RPMI1640+10 % FBS)混勻已融化的腫瘤細胞懸液，於1500轉 /分，離心8分鐘；
[0045] 3.棄上清，再吸取8. Oml培養基質混勻細胞沉澱，再1500轉/分，離心8分鐘，棄 上清，細胞沉澱用I. Oml培養基混勻，備用；
[0046] 4.另取一個75cm2方瓶，加入14.0ml培養基質，將上述製備的含腫瘤細胞懸液 (LOml)加入此方瓶中，於37°C，5% CO2孵育箱中培養；
[0047] 5.腫瘤細胞呈貼壁生長，經過3-4天，腫瘤細胞生長至80%-95%單層時，棄上清， 用0. 5mM的EDTA (難消化的腫瘤細胞用0. 25 %胰酶I. Oml)，處理腫瘤細胞大約3-5分鐘，用 倒置顯微鏡觀察，當90%的腫瘤細胞變圓時，即可用彎管吹打並將消化的細胞轉移到15ml 離心管中，於1500轉/分下，離心8分鐘，棄上清；
[0048] 6.向步驟（5)加入緩衝液重懸細胞，採用⑶133免疫磁珠分選系統從細胞液中分 選出CD133陽性腫瘤幹細胞，按照每IO 7個細胞加入60ul緩衝液的量向其中加入緩衝液重 懸形成細胞液。所用緩衝液為PBS緩衝液，其中含有0. 5% BSA，2mM EDTA，pH為7. 2(文中 出現的緩衝液，若為特別說明，均採用該緩衝液）。
[0049] 7.採用CD133免疫磁珠分選系統從細胞液中分選出CD133陽性幹細胞，免疫磁珠 分選系統是本【技術領域】的現有技術，採用CD133免疫磁珠分離試劑盒進行分選，可按照試 劑盒的操作說明進行，具體可參照如下步驟進行：
[0050] 7. 1向步驟（6)獲得的細胞液中加入20ul受體阻斷劑FcR/107細胞，再向其中加 入20ul CD133磁珠/IO7細胞；
[0051] 7. 2混勻後，在2-8°C冰箱內孵育15分鐘，期間不停輕搖；
[0052] 7. 3 按每 IO7 個細胞加入 l-2ml PBS 緩衝液（含 0· 5% BSA，2mM EDTA，ρΗ7· 2)進 行清洗，以IOOOrpm離心5min，棄上清；
[0053] 7. 4離心後，向其中加入500ul Buffer重懸細胞，備用，以便進入分離階段；
[0054] 7. 5預先將LS分離柱與分選器（分選磁鐵）相匹配連接好；
[0055] 7. 6準備好衝洗的buffer液，其中MS柱：500ul，LS柱3ml ;
[0056] 7. 7加細胞懸液入LS柱，非標記的細胞（⑶133陰性細胞）自動流下；
[0057] 7. 8清洗柱子後，移去柱子，並將柱子固定在適合的收集管上；
[0058] 7. 9向柱子中加入buffer液進行洗柱，以衝去標記的細胞，收集洗液即得⑶133陽 性幹細胞。
[0059] 8.⑶133陽性幹細胞（CSC)培養：將步驟（7)獲得的⑶133陽性幹細胞在DMEM/ F12培養液中進行成團培養，其中，所述DMEM/F12培養液中添加有生長因子rhEGF20ng/ml、 rhbFGF10ng/ml、硫酸肝素4ug/ml、胎牛血清0.15% (質量）、青黴素-鏈黴素雙抗1% (質 量）；
[0060] 9.步驟（8)中的幹細胞培養至一定數目（IXlO5?5X105)後反覆凍融，按照陽 性幹細胞、甘露聚糖肽及脂肪乳按體積比為3:1:1的量混勻，得到腫瘤幹細胞疫苗。
[0061] 經步驟（1)?（7)後獲得的肝癌幹細胞，將其培養至一定數量後，取IO6個細胞上 樣，通過流式細胞儀檢測其幹細胞的陽性率，結果如圖IA所示。而採用傳統的腫瘤細胞培 養，其獲得的結果如圖IB所示。
[0062] 圖IB的結果具體是這樣獲得的：肝癌細胞QGY_7701 (含CSC)，經復甦後，力口 RPMI1640液與10% FBS培養擴增，至一定數量後，抽提出CSC，取IO6個細胞上樣，得到流式 圖1B。
[0063] 由圖1A、圖IB可以看出，本實施例的方法獲得的腫瘤幹細胞產量更高，而且陽性 率更高，達到90%。
[0064] 實施例2 :注射肝癌幹細胞疫苗後的療效觀察
[0065] 將實施例1製得肝癌幹細胞疫苗應用於肝癌患者的治療，其詳細實驗過程如下： 隨機抽取30名肝癌患者，分為兩組，其中15名接受實施例1製得的疫苗注射治療，作為治 療組；另15人不做疫苗處理，作為對照組。注射患者前抽取每個患者5ml血，檢測外周血 淋巴細胞數目（T BNK檢測試劑盒）和淋巴細胞功能（6colour T BNK With Trucount檢測 試劑盒），經流式細胞儀檢測得出報告單。治療組的患者，通過皮下向肝癌患者體內輸入疫 苗劑量500ul，間隔一周後，再次注射一次，即每個療程周期是14天，隔周注射一次；治療組 的患者不進行化療、放療及其他免疫治療。對照組的患者進行常規化療、放療及其他免疫治 療。在15天時，再次抽取每位患者5ml血，再次檢測外周血淋巴細胞數目，與兩周前對比， 結果如下表1所示。表1為治療組在未注射疫苗與注射疫苗後淋巴細胞檢測和淋巴細胞功 能檢測結果的統計。
[0066] 表1 :為未注射疫苗與注射疫苗後（14天）免疫檢測比較
[0067]

【權利要求】
1. 一種肝癌幹細胞疫苗，其特徵在於，包括：按體積比為3:1:1混合的滅活的肝癌幹細 胞、甘露聚糖肽和脂肪乳。
2. -種肝癌幹細胞疫苗的製備方法，其特徵在於，包括以下步驟： 獲得肝癌幹細胞； 將所述肝癌幹細胞滅活；以及 將滅活的肝癌幹細胞凍融在生理鹽水裡，與佐劑甘露聚糖肽、脂肪乳混勻，從而獲得所 述的肝癌幹細胞疫苗。
3. 根據權利要求2所述的肝癌幹細胞疫苗的製備方法，其特徵在於，所述滅活包括：將 肝癌幹細胞由-80°C至20°C反覆凍融五次致死。
4. 根據權利要求2所述的肝癌幹細胞疫苗的製備方法，其特徵在於：所述肝癌幹細胞、 甘露聚糖肽和脂肪乳的混合比例為3:1:1 (體積比）。
5. 根據權利要求2所述的肝癌幹細胞疫苗的製備方法，其特徵在於：所述的肝癌幹細 胞是⑶133陽性肝癌幹細胞。
6. 根據權利要求5所述的肝癌幹細胞疫苗的製備方法，其特徵在於，所述的CD133陽性 肝癌幹細胞是通過以下步驟製備的： A. 將液氮或_80°C保存的肝癌細胞於37°C水浴，快速溶化； B. 用8. Oml的含10% FBS的RPMI1640培養基混勻已融化的肝癌細胞懸液，於1500轉 /分，離心8分鐘； C. 棄上清，再吸取8. 0ml培養基質混勻細胞沉澱，再1500轉/分，離心8分鐘，棄上清， 細胞沉澱用1. 〇ml培養基混勻，備用； D. 另取一個75cm2方瓶，加入14. 0ml培養基質，將1. 0ml上述製備的含肝癌細胞懸液 加入此方瓶中，於37°C，5% 0)2孵育箱中培養； E. 肝癌細胞呈貼壁生長，經過3-4天，肝癌細胞生長至80% -95%單層時，棄上清，用 0. 5mM的EDTA，處理肝癌細胞大約3-5分鐘，用倒置顯微鏡觀察，當90%的肝癌細胞變圓時， 即可用彎管吹打並將消化的細胞轉移到15ml離心管中，於1500轉/分下，離心8分鐘，棄 上清，計數，若細胞數不足，擴增至三個培養瓶，繼續消化離心； F. 加入緩衝液重懸細胞，採用CD133免疫磁珠分選系統從細胞液中分選出CD133陽性 肝癌幹細胞； G. 將前一步驟獲得的CD133陽性肝癌幹細胞在DMEM/F12培養液中進行培養； H. 37°C、5% C02孵育箱中培養5-7天，從而獲得足夠用於製備肝癌幹細胞疫苗的⑶133 陽性肝癌幹細胞。
7. 根據權利要求6所述的肝癌幹細胞疫苗的製備方法，其特徵在於，所述步驟E中，在 加入EDTA的同時加入0. 25%胰酶1. 0ml以消化腫瘤細胞。
8. 根據權利要求6所述的肝癌幹細胞疫苗的製備方法，其特徵在於，所述步驟G中，在 DMEM/F12培養液中添加：生長因子rhEGF15?25ng/ml、rhbFGF5?15ng/ml、硫酸肝素2? 6ug/ml、胎牛血清0· 1?0· 2% (質量百分比）和青黴素-鏈黴素雙抗0· 5?1. 5% (質量 百分比）。
9. 根據權利要求6所述的肝癌幹細胞疫苗的製備方法，其特徵在於，所述步驟Η中， 所述足夠用於製備肝癌幹細胞疫苗的CD133陽性肝癌幹細胞是培養至細胞個數達到 1X105?5X105/ml的CD133陽性肝癌幹細胞。
10.根據權利要求2至9之一所述的製備方法獲得的肝癌幹細胞疫苗用於製備治療肝 癌的藥物中的用途。
【文檔編號】A61P35/00GK104258383SQ201410503127
【公開日】2015年1月7日 申請日期:2014年9月26日 優先權日:2014年9月26日
【發明者】陳繼冰, 林茂, 左建生, 劉建國, 徐克成, 牛立志 申請人:廣州復大醫療股份有限公司復大腫瘤醫院