一種針對疾病個體化用藥的基因分型快速試紙條檢測方法

2023-05-21 09:13:06 2

專利名稱：一種針對疾病個體化用藥的基因分型快速試紙條檢測方法
技術領域：
本發明涉及一種個體化用藥檢測技術，具體涉及針對心血管抗凝藥基因個體化用藥之快速分型檢測方法。
背景技術：
《中國心血管病報告2010》顯示，我國每年300萬人死於心血管疾病，居死因之首，其用藥安全和有效性備受關注。氯吡格雷已成為臨床抗血栓治療的一線用藥。然而，約30%患者服用該藥後療效不佳，甚至產生嚴重不良反應。研究表明，氯吡格雷抵抗與ABCBl基因多態性、細胞色素P450酶代謝活性、ADP受體多態性均相關。其中CYP2C19基因多態性(關於細胞色素P450酶代謝活性)是增加心肌梗死、中風和支架內血栓的主要影響因素，其多態性會導致藥物代謝酶的多態性，使酶活性呈現高、低或無活性狀態。因此，代謝類型被分為了以下四種超強代謝UM (純合超強代謝CYP2C19*17/*17，雜合超強代謝 CYP2C19*1/*17)、強代謝組EM (純合強代謝CYP2C19*1/*1 )、中間代謝組頂(雜合型中間代謝CYP2C19*l/*2和CYP2C19*l/*3)及弱代謝組PM (雜合型弱代謝CYP2C19*2/*3，純合型弱代謝CYP2C19*2/*2)。以基因分型為基礎的個體化用藥治療會成為降低不良反應和增加藥效的一種有效手段。研究表明CYP2C19*2和CYP2C19*3兩種突變可解釋>99%的東方人弱代謝者以及約88%的白種人弱代謝者的表型。其中*2突變是PM產生的主要原因。中國人群CYP2C19*2和*3等位基因佔30%及8%，CYP2C19*2和*3基因被證實為亞洲人對該藥抵抗的危險因素。螢光定量PCR、質譜法、基因晶片或傳統的酶切方法相比，均已被用來檢測SNPJS這些方法存在操作複雜、檢測時間長，或需要價格昂貴的大型儀器設備等方面的限制，因此並不適合於大多數臨床醫院在常規的臨床檢驗中推廣使用，所以研究並開發用於個體化用藥相關新型檢測關鍵技術和相關檢測廣品有重大意義。發明目的本發明的目的是提供一種針對疾病個體化用藥的基因分型快速試紙條檢測方法，以解決背景技術的方法操作複雜、檢測時間長等問題、或需要價格昂貴的大型儀器設備等方面的限制。為實現上述發明目的，本發明提出了以下基本技術方案一種針對疾病個體化用藥的基因分型快速試紙條檢測方法，包括以下步驟(I)針對待檢測樣本基因組 DNA 的 CYP2Cl9*2 (681G>A), CYP2C19*3 (636G>A),CYP2C19*17 (-8060T)這三個SNP位點，對每一個SNP位點均設計一條野生型特異性引物、一條突變型特異性引物和一條共用引物進行識別與擴增；在野生型特異性引物和突變型特異性引物的Y端均標記地高辛，共用引物的Y端標記生物素；(2)針對一個SNP位點，平行做兩管PCR反應，其中一管加入共用引物與等量的突變型特異性引物，另一管中加入共用引物與等量的野生型特異性引物，兩管的PCR反應條件相同並同時置於PCR儀中反應；這樣，對於(I)步驟中所述的三個SNP位點，共做六管PCR反應；Taq聚合酶的特異性決定了 PCR反應能否順利進行；(3)利用鏈親和素金磁微粒特有的可目視化特性，採用層析技術並以生物素和鏈親和素作用，對步驟(2)得到的擴增產物中SNP基因型完成分型檢測；其中，層析技術採用的試紙條滿足a、試劑條的免疫層析膜(硝酸纖維素膜)上的質控線處包被有質控用生物素；b、檢測線處包被有捕獲用抗地高辛抗體；C、結合墊上噴塗有鏈親和素金磁微粒；經步驟(2)取出的兩管PCR產物分別滴至兩支試紙條的樣品墊上進行檢測，質控線顯色表明此次實驗有效，即步驟(2)的該管PCR反應順利，即得到的產物一端標記有生物 素，另一端標記有地高辛，滴加至上樣墊，一端的生物素與鏈親和素磁粒特異性結合之後，通過層析作用上移至檢測線處，另一端上的地高辛與檢測線上的抗地高辛抗體特異性結合顯色，由此判斷出其基因型滴加含有野生型特異性引物的PCR產物在試紙條的檢測線上顯色，而含有突變型特異性引物的PCR產物在試紙條的檢測線上不顯色，則表明基因型為野生型；反之基因型為突變型；若兩支試紙條的檢測線均顯色，則表明基因型為雜合型。上述步驟⑴中設計的引物序列如下CYP2C19*2 (681G>A)引物序列
權利要求
1.一種針對疾病個體化用藥的基因分型快速試紙條檢測方法，其特徵在於，包括以下步驟 (1)針對待檢測樣本基因組DNA 的 CYP2C19*2 (681G>A)、CYP2C19*3 (636G>A)、CYP2C19*17 (-8060T)這三個SNP位點，對每一個SNP位點均設計一條野生型特異性引物、一條突變型特異性引物和一條共用引物進行識別與擴增；在野生型特異性引物和突變型特異性引物的Y端均標記地高辛，共用引物的Y端標記生物素； (2)針對一個SNP位點，平行做兩管PCR反應，其中一管加入共用引物與等量的突變型特異性引物，另一管中加入共用引物與等量的野生型特異性引物，兩管的PCR反應條件相同並同時置於PCR儀中反應；這樣，對於(I)步驟中所述的三個SNP位點，共做六管PCR反應；Taq聚合酶的特異性決定了 PCR反應能否順利進行； (3)利用鏈親和素金磁微粒特有的可目視化特性，採用層析技術並以生物素和鏈親和素作用，對步驟(2)得到的擴增產物中SNP基因型完成分型檢測； 其中，層析技術採用的試紙條滿足 a、試劑條的免疫層析膜上的質控線處包被有質控用生物素； b、檢測線處包被有捕獲用抗地高辛抗體； C、結合墊上噴塗有鏈親和素金磁微粒； 經步驟(2)取出的兩管PCR產物分別滴至兩支試紙條的樣品墊上進行檢測，質控線顯色表明此次實驗有效，即步驟(2)的該管PCR反應順利，即得到的產物一端標記有生物素，另一端標記有地高辛，滴加至上樣墊，一端的生物素與鏈親和素磁粒特異性結合之後，通過層析作用上移至檢測線處，另一端上的地高辛與檢測線上的抗地高辛抗體特異性結合顯色，由此判斷出其基因型 滴加含有野生型特異性引物的PCR產物在試紙條的檢測線上顯色，而含有突變型特異性引物的PCR產物在試紙條的檢測線上不顯色，則表明基因型為野生型；反之基因型為突變型；若兩支試紙條的檢測線均顯色，則表明基因型為雜合型。
2.根據權利要求I所述的檢測方法，其特徵在於，步驟(I)中設計的引物序列如下 CYP2C19*2 (681G>A)引物序列 引物名稱Y~m\CYP2C19+2F 51 Biotin-ACAACCAGAGCTTGGCATATTGT-31CYP2C19*2R(M) 5, Dig-GGTTTTTAAGTAATTTGTTATGGGTTGCT-3,CYP2C19*2R(Wt) 5, Dig-TTTTTAAGTAATTTGTTATGGGTTGCC-3, CYP2C19*3 (636G>A)引物序列 引物名稱Y~m\CYP2C19+3F 51 Biotin-TGTGCTCCCTGCAATGTGAT-31CYP2C19*3R(M) 5, Dig-AAAAAACTTGGCCTTACCTGGAAT-3,
3.根據權利要求2所述的檢測方法PCR反應過程依次為95°C預變性5min，94°C變性30s，60。。退火30s，72。。延伸45s，進行31個循環，72°C終延伸IOmin。
4.根據權利要求I至3任一所述的檢測方法，其特徵在於所述鏈親和素金磁微粒的主體納米金磁微粒為核殼結構的超順磁性複合微粒，其核為納米磁性粒子，核表面是金的殼層，利用表面金的性質，無需共價偶聯試劑，能夠將鏈親和素偶聯在其表面形成鏈親和素金磁微粒。
全文摘要
本發明公開了一種針對疾病個體化用藥的基因分型快速試紙條檢測方法。該快速分型檢測方法包括以下幾個重要的環節基於AS-PCR的方法，對CYP2C19*2、CYP2C19*3、CYP2C19*17等位基因位點進行識別與擴增。利用擴增片段標記的生物素和納米金磁微粒表面鏈親和素相互作用，結合側向流技術，實現基因分型快速檢測。利用金磁微粒作為雜交載體，無需對目的片段進行純化、濃縮而導致的高成本、費時、費力的問題。
文檔編號C12Q1/68GK102776279SQ20121017134
公開日2012年11月14日 申請日期2012年5月29日 優先權日2012年5月29日
發明者崔亞麗, 張秦魯, 惠文利, 朱娟莉, 魏旭旭 申請人:西安金磁納米生物技術有限公司