一種幹細胞複合藥物、其製備方法及其用途的製作方法
2023-05-21 00:17:41
專利名稱：一種幹細胞複合藥物、其製備方法及其用途的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種幹細胞複合藥物、其製備方法及其在製備治療各種肝病上的途，特別是採用存在於人類或哺乳類動物的胚胎、血液或幼體肝臟中，用生化方法提取出來的一種幹細胞誘導因子，複合從人或其他哺乳動物的胚胎、臍帶血、脊髓、等組織中製備的幹細胞的複合藥物，其製備方法及其在用於製備促進幹細胞向成熟肝臟細胞轉化及治療肝臟疾病藥物上的應用。
幹細胞是一種具有自我更新能力的多潛能原始細胞，在一定條件下可定向誘導成為各種類型的成體細胞，被用於各種用傳統方法難於治癒的細胞損傷型疾病。幹細胞的治療正在成為一類全新的有效的治療方法。
幹細胞作為一種新的治療方式，已成為臨床研究的熱點。幹細胞的治療是相對安全的。但如何使幹細胞定向誘導，使其分化成為所需的成體細胞並具有成體細胞的功能是尤為重要的。
幹細胞包括胚胎幹細胞和成體幹細胞。幹細胞的發育受多種內在機制和微環境因素的影響。目前人類胚胎幹細胞已可成功地在體外培養。最新研究發現，成體幹細胞可以橫向分化為其他類型的細胞和組織，為幹細胞的廣泛應用提供了基礎。研究幹細胞增殖和分化機制的最終目的是通過幹細胞治療疾病。理論上講，幹細胞可以用於各種疾病的治療，但其最適合的疾病主要是組織壞死性疾病、退行性病變、自體免疫性疾病等。幹細胞作為一種新的治療方式，已成為臨床研究的熱點。
肝臟是人體代謝的樞紐，根據有關醫學專家研究，在當前及未來相當一段時間內，肝臟疾病將是威脅人類健康的最重要因素之一。據不完全統計，我國B肝病毒攜帶者佔10％，C肝感染率平均為3.2％，全球每年死於肝炎後慢性肝病的病人中，就有42.5％在中國。可見尋找有效治療肝臟疾病的藥物，是非常重要的。
本發明的目的在於公開一種幹細胞複合藥物，特別是存在於人類或哺乳類動物的胚胎、血液或幼體肝臟中，用生化方法提取出來的一種幹細胞複合藥物，該複合藥物可提高幹細胞及幹細胞誘導因子的療效、促進肝臟增殖並可用於治療各種原因引起的肝臟疾病。
本發明的另一目的在於公開一種從人類或其他哺乳類動物的胚胎、血液、脊髓、臍帶血或幼體哺乳類動物肝臟中製備的幹細胞複合藥物的製備方法。
本發明的再一目的在於公開一種幹細胞複合藥物在製備促進幹細胞向成熟肝臟細胞轉化及治療肝臟疾病藥物上的應用。
上述目的通過以下技術方案來實現一種幹細胞複合藥物，包括幹細胞和肝細胞誘導因子；其中所述的幹細胞是以人胚胎、臍帶血、脊髓等為原料，採用免疫磁珠陽性篩選製備的幹細胞；所述的肝細胞誘導因子由哺乳類動物胚胎或幼體肝臟中提取，經層析方法分離、純化的具有生物學活性的小分子量多肽，分子量為0.8-6KD，優選1.2-6KD。
使用時可以先使用幹細胞誘導因子，然後用異源幹細胞，也可以先用異源幹細胞，再用細胞誘導因子，二者協同作用，促進異源幹細胞在肝臟存活，並促進幹細胞向肝臟細胞的轉化。
本發明幹細胞的製備方法包括如下步驟4)將原料稀釋得到稀釋液；5)單核細胞的獲得；6)免疫磁珠陽性篩選。
其中步驟1)中的原料稀釋是採用以20ml枸櫞酸-枸櫞酸鈉(簡稱ACD)和葡萄糖(簡稱CB)的PBS緩衝溶液稀釋臍帶血或脊髓塊等，得到臍帶血或脊髓稀釋液；緩衝溶液中ACD∶CB＝1∶6，CB∶PBS＝1∶4。
或將人或其他哺乳動物的胚胎勻漿。
步驟2)中通過下述方法獲得單核細胞按照Ficoll∶CB＝3∶7的量用Ficoll分層，，4℃ 800g離心30分鐘，收集界面層後，在4℃ 500g離心20分鐘，棄上清，得到脊髓單核細胞收集界面層。
上述製備方法中還包括採用流式細胞儀分選幹細胞。
當採用臍帶血為原料時，還包括將棄上清後的沉澱物用紅細胞裂解液4℃下裂解10分鐘。用PBS緩衝液洗滌細胞，300g離心20分鐘，採用流式細胞儀分選幹細胞，得到臍帶血的單核細胞(MNC)。
步驟3)中的免疫磁珠陽性篩選為採用MNC∶Dynabeads M-450CD34∶Detachabead CD34＝4×108∶4×107∶4×107＝1ml∶100μl∶100μl。Dynabeads M-450 CD34洗滌，置於磁板(MPC)1分鐘，棄清液，PBS緩衝液洗滌2次。混合磁珠(MACS，Miltenyi公司產品)和臍帶血的單核細胞的CD34溶液，4℃微旋孵育30分鐘，陽性篩選CD34+細胞。
玫瑰花環狀細胞—磁珠重新懸起，置於磁板(MPC)2分鐘，棄清液，重複3次，得玫瑰花環狀細胞—磁珠，懸於100μl PBS緩衝液。Detachabead CD34解離細胞，微旋孵育45分鐘，加2ml PBS緩衝液，混勻，置於磁板(MPC)2分鐘，收集細胞清液，重複3次，匯集細胞清液，置於MPC 2分鐘，除去殘留磁珠，將細胞清液移入錐形試管。離心、洗滌2次，細胞計數，流式細胞儀FACS檢測。
為避免胞內冰晶損傷和溶液損傷，採用人胚胎細胞較多應用的玻璃化凍存方法。首先冰浴預冷凍存液，細胞離心管置於冰水浴操作，沿離心管壁緩加凍存液(何種凍存液)，至細胞終濃度為1×1061.5×106，吹吸勻。分裝於凍存管中，火焰封口，將凍存管直接投入液氮罐保存，降溫速度約為600℃/min，進行細胞凍存。細胞培養時，細胞濃度調至1×106培養。
本發明中採用MTT法測定幹細胞增殖來鑑定所得幹細胞的活性。具體為以無血清培養基製備單細胞懸液，接種於培養板中，加入MTT(中文名)溶液，孵育，離心，棄培養板孔內上清，加入二甲基亞碸。酶聯免役檢測儀測定OD570檢測幹細胞是否出現明顯增殖，如有增殖說明所製備的幹細胞具有活性。
本發明中採用免疫組化法檢查幹細胞是否向肝細胞轉化，具體為取細胞塗片，丙酮固定，加稀釋一抗(白蛋白1∶50；CK81∶10)，37℃ 40分鐘，PBS洗3次，每次3分鐘。加FITC標記的二抗(1∶50稀釋)，37℃條件下保存40分鐘。PBS洗3次每次3分鐘。緩衝甘油封片，螢光顯微鏡下檢查。實驗結果表明人幹細胞增殖及向肝細胞轉化。
CD34+細胞用Hoechest33342、PKH26雙標，尾靜脈注射幹細胞藥物。取觀察臟器製成冰凍切片、石蠟切片。細胞形態學鑑定採用紫外螢光顯微成像，雷射共聚焦細胞儀觀察。細胞人源性檢測採用PCR技術，提取組織中的DNA，用PCR的方法特異性的擴增人Alu序列，用於區分人和鼠的細胞。如果PCR擴增有陽性結果，可進一步通過用人Alu序列的核酸探針進行原位雜交鑑定。細胞造血幹細胞性質檢測採用CD34+CD38+雙標，Confolcal檢測。CD34+細胞，Hoechest33342、PHK26雙標，尾靜脈注射入裸鼠，加幹細胞誘導因子SIF，取肝製成冰凍切片，雷射共聚焦細胞儀檢測。CD34+細胞，Hoechest33342、PHK26雙標，尾靜脈注射入裸鼠，加SIF的PBS緩衝液，取肝製成冰凍切片，雷射共聚焦細胞儀檢測。CD34+細胞，Hoechest33342、PHK26雙標，尾靜脈注射入裸鼠，取肝製成冰凍切片，雷射共聚焦細胞儀檢測。
肝性化檢測，採用免疫組化方法可用CK14、CK19、清蛋白、AFP分別鑑定。肝細胞標記還可用HepParl，OC可採用OV-6和CD-117標記。免疫組化設立人肝陽性對照、鼠肝陰性對照。
本發明所述的肝細胞誘導因子是來源於人類或哺乳類動物胚胎肝臟的多肽類轉化因子。其製備方法是取健康未哺乳新生牛、乳豬或乳羊等哺乳類動物的肝臟處理後，冰浴中在勻漿器勻漿，過濾組織碎片，超聲波細胞粉碎(冰浴)，高溫變性，醇沉，離心，取沉澱物溶於0.02M Tris-HCL(PH7.7)，DEAE離子交換樹脂層析分離(或研磨、離心後經截留分子量小於20kD的濾膜過濾，濾液經濃縮凍幹，用Sephadex LH 20層析柱製備層析分離分子量0.8-11kD的組分，以DEAE離子交換層析分離。)0-0.7M NaCl連續梯度洗脫，收集0.5M NaCl處洗脫液，凍幹或製成無菌水溶液、顆粒劑、膠囊等，冷暗處保存，即得。
本發明採用紫外分光光度法測定鑑別所述的肝細胞誘導因子。濃度為1mg/ml時PH為6.8，蛋白質、異常毒性、過敏試驗、無菌等檢查均符合《中國藥典》2000年版(二部)各項下要求。
下面結合附圖和具體實施例詳細描述本發明，所述的實施例是用於描述本發明，而不是限制本發明。
圖1.CD34+細胞，Hoechest33342、PHK26雙標，幹細胞誘導因子SIF作用於肝臟的雷射共聚焦細胞儀檢測結果圖；圖2.CD34+細胞，Hoechest33342、PHK26雙標，加SIF的PBS緩衝液，取肝製成冰凍切片，雷射共聚焦細胞儀檢測結果圖；圖3.CD34+細胞，Hoechest33342、PHK26雙標，取肝製成冰凍切片，雷射共聚焦細胞儀檢測結果圖；幹細胞誘導因子的活性鑑定，採用(1)運用流式細胞儀分離人臍血中的造血幹細胞。CD34抗體標記，採用流式細胞儀分選CD34+細胞，並以無血清培養基調整細胞濃度為1×105個/ml細胞，按每孔1×104個細胞接種於96孔培養板。(2)以MTT法測定幹細胞增殖，以無血清培養基製備單細胞懸液，以每孔1×104個細胞接種於96孔培養板中，每孔體積為200μl，培養3天，接種細胞。每孔加入MTT溶液20μl(5mg/ml)，孵育4小時。1000轉/分，離心5分鐘。棄培養板孔內上清。每孔加入150μl二甲基亞碸，震蕩15分鐘。酶聯免役檢測儀測定OD570。(3)免疫組化法檢查幹細胞是否向肝細胞轉化，採用細胞塗片，丙酮固定10分鐘。加稀釋一抗(白蛋白1∶50；CK81∶10)37℃×40分鐘。PBS洗3×3分鐘。加FITC標記的二抗(1∶50稀釋)37℃×40分鐘。PBS洗3×3分鐘。緩衝甘油封片。螢光顯微鏡下檢查。實驗表明幹細胞誘導因子能促進人幹細胞增殖及向肝細胞轉化。
幹細胞誘導因子潛在藥物療效的評價，在整體動物水平探索幹細胞誘導因子對肝臟疾病的治療作用，在整體動物水平和細胞水平上評價在造血幹細胞向肝細胞轉化過程中幹細胞誘導因子的作用。免疫磁珠陽性篩選獲得實驗所需臍帶血CD34+細胞，並建立細胞藥物篩選平臺。細胞凍存或細胞濃度調至1×106培養，為避免胞內冰晶損傷和溶液損傷，採用人胚胎細胞較多應用的玻璃化凍存方法。CD34+細胞用Hoechest33342、PKH26雙標尾靜脈注射，加幹細胞誘導因子組首次因子劑量加倍，以後每天皮下注射追加因子。定期處死動物，取肝、脾，製成冰凍切片、石蠟切片。採用紫外螢光顯微成像、雷射共聚焦細胞儀進行細胞形態學鑑定。提取組織中的DNA，用PCR的方法特異性的擴增人Alu序列，用於區分人和鼠的細胞。進行細胞人源性檢測。PCR擴增有陽性結果後，進一步通過用人Alu序列的核酸探針進行原位雜交鑑定。以CD34+CD38+雙標，Confolcal進行造血幹細胞性質檢測。採用免疫組化方法進行肝性化檢測。所用動物均為裸鼠肝纖維化損傷模型。CD34+細胞，Hoechest33342、PHK26雙標，尾靜脈注射入裸鼠，加幹細胞誘導因子SIF，取肝製成冰凍切片，雷射共聚焦細胞儀檢測，結果見圖1。CD34+細胞，Hoechest33342、PHK26雙標，尾靜脈注射入裸鼠，加SIF的PBS緩衝液，取肝製成冰凍切片，雷射共聚焦細胞儀檢測。CD34+細胞，Hoechest33342、PHK26雙標，尾靜脈注射入裸鼠，取肝製成冰凍切片，雷射共聚焦細胞儀檢測，結果見圖3。實驗結果表明幹細胞誘導因子對肝臟疾病的具有良好的治療作用，在造血幹細胞向肝細胞轉化過程中幹細胞誘導因子具有明顯的促進作用，可阻止肝細胞壞死，肝細胞DNA的合成明顯加快，促進肝細胞再生的作用，加速肝臟組織的修復。
本發明所述的幹細胞誘導因子也可以採用現有技術中公開的從動物體內提取的各種促肝細胞生長素及具有類似功能的藥物。
本發明中，採用幹細胞誘導因子與異源幹細胞(如人造血幹細胞，胚胎幹細胞等)協同使用，使用時可以先用幹細胞誘導因子，然後用異源幹細胞，也可以先用幹異源幹細胞，再用細胞誘導因子，二者協同作用，促進異源幹細胞在肝臟存活，並促進幹細胞向肝臟細胞的轉化，可用於幹細胞治療各種肝病。注射用量100ug/kg，一日一次，10-14天為一療程。亦可單獨應用於各種急慢性肝病。促進肝細胞的再生和肝臟組織的損傷修復。
本發明經MNC細胞獲取、CD34抗體標記、流式細胞儀分選及細胞接種分離幹細胞，方法簡便快捷；以MTT法測定幹細胞增殖，免疫組化法檢查幹細胞是否向肝細胞轉化，特異性強；所述的幹細胞複合藥物經誘導可定向轉化，用於幹細胞治療各種疾病及進行細胞藥物的篩選，對各種原因引起的急、慢性肝臟疾病適應症患者肌注或靜注、口服給藥，實用有效。本發明的幹細胞複合藥物可有效地促進自體或異體幹細胞在肝臟的增殖及轉化，通過肝細胞再生及細胞誘導因子的協同作用，達到提高和恢復肝功能的目的，可用於各種急、慢性肝病的治療。本發明的幹細胞複合藥物具有特異的生物活性，安全無毒、無致病性。另外本發明因無種屬特異性，所以可從多種哺乳類動物的胚胎和幼體肝臟提取、分離，純化，生產工藝簡單。
實施例1取人14周胚胎脊髓約5g剪碎，以20ml枸櫞酸-枸櫞酸鈉(簡稱ACD)和葡萄糖(簡稱CB)的PBS緩衝溶液稀釋，得到脊髓稀釋液；緩衝溶液中ACD∶CB＝1∶6，CB∶PBS＝1∶4。
脊髓稀釋液用Ficoll(Sigma公司產品)分層，Ficoll∶CB＝3∶7，4℃ 800g離心30分鐘。收集界面層後，在4℃ 500g離心20分鐘，棄上清，得到脊髓單核細胞(MNC)。
以磁珠(MACS，Miltenyi公司產品)陽性篩選CD34(抗體)和脊髓單核細胞(MNC)，所用抗體為Dynabeads M-450 CD34和Detachabead CD34，與MNC的比例及用量為MNC∶Dynabeads M-450 CD34抗體(Dynal公司產品)∶Detachabead CD34抗體(Dynal公司產品)＝4×108∶4×107∶4×107(濃度)＝1ml∶100μl∶100μl(用量)。
陽性篩選CD34+細胞(MNC)——混合磁珠和細胞，4℃下微旋孵育30分鐘。
首先用Dynabeads M-450 CD34洗滌脊髓單核細胞，置於磁板(MPC)1分鐘，棄清液後，用PBS緩衝液洗滌4次。
陽性篩選CD34+細胞(MNC)，——將玫瑰花環狀細胞——磁珠重新懸起，置於磁板(MPC)2分鐘，棄清液，重複3次，得玫瑰花環狀細胞—磁珠，懸於100mlPBS緩衝液中。用Detachabead CD34解離細胞，微旋孵育45分鐘，加2ml PBS緩衝液混勻，置於磁板(MPC)2分鐘，收集細胞清液，重複3次，匯集細胞清液，置於磁板(MPC)2分鐘，除去殘留磁珠，將細胞清液移入錐形試管。離心、洗滌2次，細胞計數，CD34、CD3雙標，流式細胞儀(FACS)檢測MACS陽性篩選CD34+細胞。得到脊髓幹細胞。
為避免胞內冰晶損傷和溶液損傷，採用人胚胎細胞較多應用的玻璃化凍存方法。首先冰浴預冷凍存液，細胞離心管置於冰水浴操作，沿離心管壁緩加凍存液，細胞終濃度為1×1061.5×106，吹吸勻。分裝於凍存管中，火焰封口，將凍存管直接投入液氮罐保存，降溫速度約為600℃/min，進行細胞凍存。
實施例2參考實施例1的方法，具體操作如下取人臍帶血約100ml，以枸櫞酸-枸櫞酸鈉(簡稱ACD)和葡萄糖(簡稱CB)的PBS緩衝溶液稀釋，得到臍帶血的稀釋液，緩衝溶液中ACD∶CB＝1∶6，CB∶PBS＝1∶4。
人臍帶血稀釋液用Ficoll(Sigma公司產品)分層，Ficoll∶CB＝3∶7，4℃ 800g離心30分鐘。收集界面層後，在4℃ 500g離心20分鐘，棄上清。沉澱物用紅細胞裂解液4℃下裂解10分鐘。用PBS緩衝液洗滌細胞，300g離心20分鐘，採用流式細胞儀分選幹細胞，細胞計數，FASC檢測，調整細胞至4×107，得到臍帶血的單核細胞(MNC)。
採用MNC∶Dynabeads M-450 CD34∶Detachabead CD34＝4×108∶4×107∶4×107＝1ml∶100μl∶100μl。Dynabeads M-450 CD34洗滌，置於磁板(MPC)1分鐘，棄清液，PBS緩衝液洗滌2次。混合磁珠(MACS，Miltenyi公司產品)和臍帶血的單核細胞的CD34溶液，4℃微旋孵育30分鐘，陽性篩選CD34+細胞。
玫瑰花環狀細胞—磁珠重新懸起，置於磁板(MPC)2分鐘，棄清液，重複3次，得玫瑰花環狀細胞—磁珠，懸於100μl PBS緩衝液。Detachabead CD34解離細胞，微旋孵育45分鐘，加2ml PBS緩衝液，混勻，置於磁板(MPC)2分鐘，收集細胞清液，重複3次，匯集細胞清液，置於MPC 2分鐘，除去殘留磁珠，將細胞清液移入錐形試管。離心、洗滌2次，細胞計數，流式細胞儀FACS檢測。
實施例3同實施例1，不同之處在於採用10周豬胚胎脊髓為原料，得到豬脊髓幹細胞。
實施例4同實施例2，不同之處在於採用牛臍帶血為原料，得到牛臍帶血幹細胞。
實驗例1幹細胞活性的鑑定方法如下MTT法測定幹細胞增殖將實施例1-4的幹細胞細胞濃度分別調至1×106，以無血清培養基分別製備上述實施例的單細胞懸液，按每孔1×104個細胞接種於96孔培養中，每孔體積為200μl，培養3天，接種細胞。每孔加入MTT溶液20μl(5mg/ml)，孵育4小時。1000轉/分，離心5分鐘。棄培養板孔內上清。每孔加入150μl二甲基亞碸，震蕩15分鐘。酶聯免役檢測儀測定OD570，實施例1-4的實驗結果都表明幹細胞出現明顯增殖，說明所製備的幹細胞具有活性。
實驗例2本實驗例涉及幹細胞向肝細胞轉化活性的鑑定採用免疫組化法檢查幹細胞是否向肝細胞轉化取細胞塗片，丙酮固定10分鐘。加稀釋一抗(白蛋白1∶50；CK81∶10)，37℃下放置40分鐘，PBS緩衝液洗3次，每次3分鐘。加FITC標記的二抗(1∶50稀釋)，37℃條件下保存40分鐘。PBS洗3次每次3分鐘。緩衝甘油封片，螢光顯微鏡下檢查。實驗結果表明人幹細胞增殖及向肝細胞轉化。
實驗例3本實驗例涉及臍帶血來源的幹細胞對於肝臟損傷的修復。
裸鼠肝損傷模型造膜以40％CCl4橄欖油，0.3ml/100g，2次/周，皮下注射，6周製成肝纖維化模型。免疫磁珠陽性篩選獲得實驗所需臍帶血CD34+細胞，並建立細胞藥物篩選平臺。
依實驗分組情況進行實驗，CD34+細胞用Hoechest33342、PKH26雙標，尾靜脈注射促肝細胞生長因子(市售產品)，首次因子劑量加倍，以後每天皮下注射追加促肝細胞生長因子。定期處死動物，取肝、脾，製成冰凍切片、石蠟切片。以紫外螢光顯微成像、雷射共聚焦細胞儀，進行細胞形態學鑑定。參見圖1-3。
以PCR技術進行細胞人源性檢測。提取組織中的DNA，用PCR的方法特異性的擴增人Alu序列，用於區分人和鼠的細胞。設立人肝陽性對照、鼠肝陰性對照。PCR步驟1mm3大小的組織塊置於EP管中，加25μl 1×TE緩衝液，搗碎組織塊，取1μl組織漿置於PCR反應管中，加基因釋放劑20μl，振蕩10-30秒，加一層石蠟油，置微波爐中加熱5-7分鐘，置預調至80-90度的擴增儀上，分別按要求加入引物、Mg2+、dNTP、ddH2O、TaqDNA聚合酶，進行反應。反應結束後，進行2％瓊脂糖凝膠電泳，觀察擴增條帶。如果PCR擴增有陽性結果，可進一步通過用人Alu序列的核酸探針進行原位雜交鑑定。CD34+CD38+雙標，Confolcal檢測進行細胞造血幹細胞性質檢測。
採用免疫組化方法進行肝性化檢測，設立人肝陽性對照、鼠肝陰性對照。免疫組化步驟載玻片酸洗、預處理、石蠟切片處理、冰凍切片處理。染色步驟3％H2O2室溫孵育5～10分鐘，以消除內源性過氧化物酶活性，蒸餾水衝洗，PBS浸泡5分鐘。飽和處理內源性生物素，將切片浸入25μg/ml親和素溶液中15分鐘，PBS清洗15分鐘後即可染色。蛋白酶消化或抗原修復，具體按要求進行。5-10％正常二抗來源的動物血清封閉(PBS稀釋)，室溫孵育10分鐘，傾去血清，勿洗，滴加適當比例稀釋的一抗工作液，37度孵育1-2小時或4度過夜。(置溼盒中)PBS衝洗，5分鐘3次。滴加適當比例稀釋的生物素標記的二抗(1％BSA-PBS稀釋)，37度孵育10-30分鐘。PBS衝洗，5分鐘3次。滴加適當比例稀釋的LRP標記的鏈黴卵白素(PBS稀釋)，37度孵育10-30分鐘，PBS衝洗，5分鐘3次。顯色劑顯色(DAB或AEC)，自來水充分衝洗，復染(蘇木素)，正常羊血清封片，觀察。
上述結果表明，所製備的幹細胞可以用於治療、修復病變或失去功能的組織或器官。
實施例4幹細胞誘導因子是來源於人類或哺乳類動物胚胎肝臟的多肽類轉化因子。其生產方法是取健康未哺乳新生牛、乳豬或乳羊等哺乳類動物的肝臟處理後，冰浴中在勻漿器勻漿，過濾組織碎片，超聲波細胞粉碎(冰浴)，高溫變性，醇沉，離心，取沉澱物溶於0.02M Tris-HCL(PH7.7)，DEAE離子交換樹脂層析分離(或研磨、離心後經截留分子量小於20kD的濾膜過濾，濾液經濃縮凍幹，用Sephadex LH 20層析柱製備層析分離分子量0.8-11kD的組分，以DEAE離子交換層析分離。)0-0.7M NaCl連續梯度洗脫，收集0.5M NaCl處洗脫液，凍幹或製成無菌水溶液、顆粒劑、膠囊等，冷暗處保存，即得。
本品鑑別採用紫外分光光度法測定。濃度為1mg/ml時PH為6.8，蛋白質、異常毒性、過敏試驗、無菌等檢查均符合《中國藥典》2000年版(二部)各項下要求。
幹細胞誘導因子的活性鑑定，採用(1)運用流式細胞儀分離人臍血中的造血幹細胞。CD34抗體標記，採用流式細胞儀分選CD34+細胞，並以無血清培養基調整細胞濃度為1×105個/ml細胞，按每孔1×104個細胞接種於96孔培養板。(2)以MTT法測定幹細胞增殖，以無血清培養基製備單細胞懸液，以每孔1×104個細胞接種於96孔培養板中，每孔體積為200μl，培養3天，接種細胞。每孔加入MTT溶液20μl(5mg/ml)，孵育4小時。1000轉/分，離心5分鐘。棄培養板孔內上清。每孔加入150μl二甲基亞碸，震蕩15分鐘。酶聯免役檢測儀測定OD570。(3)免疫組化法檢查幹細胞是否向肝細胞轉化，採用細胞塗片，丙酮固定10分鐘。加稀釋一抗(白蛋白1∶50；CK81∶10)37℃×40分鐘。PBS洗3×3分鐘。加FITC標記的二抗(1∶50稀釋)37℃×40分鐘。PBS洗3×3分鐘。緩衝甘油封片。螢光顯微鏡下檢查。實驗表明幹細胞誘導因子能促進人幹細胞增殖及向肝細胞轉化。
幹細胞誘導因子潛在藥物療效的評價，在整體動物水平探索幹細胞誘導因子對肝臟疾病的治療作用，在整體動物水平和細胞水平上評價在造血幹細胞向肝細胞轉化過程中幹細胞誘導因子的作用。免疫磁珠陽性篩選獲得實驗所需臍帶血CD34+細胞，並建立細胞藥物篩選平臺。細胞凍存或細胞濃度調至1×106培養，為避免胞內冰晶損傷和溶液損傷，採用人胚胎細胞較多應用的玻璃化凍存方法。CD34+細胞用Hoechest33342、PKH26雙標尾靜脈注射，加幹細胞誘導因子組首次因子劑量加倍，以後每天皮下注射追加因子。定期處死動物，取肝、脾，製成冰凍切片、石蠟切片。採用紫外螢光顯微成像、雷射共聚焦細胞儀進行細胞形態學鑑定。提取組織中的DNA，用PCR的方法特異性的擴增人Alu序列，用於區分人和鼠的細胞。進行細胞人源性檢測。PCR擴增有陽性結果後，進一步通過用人Alu序列的核酸探針進行原位雜交鑑定。以CD34+CD38+雙標，Confolcal進行造血幹細胞性質檢測。採用免疫組化方法進行肝性化檢測。所用動物均為裸鼠肝纖維化損傷模型。CD34+細胞，Hoechest33342、PHK26雙標，尾靜脈注射入裸鼠，加幹細胞誘導因子SIF，取肝製成冰凍切片，雷射共聚焦細胞儀檢測，結果見圖1。CD34+細胞，Hoechest33342、PHK26雙標，尾靜脈注射入裸鼠，加SIF的PBS緩衝液，取肝製成冰凍切片，雷射共聚焦細胞儀檢測，結果見圖2。CD34+細胞，Hoechest33342、PHK26雙標，尾靜脈注射入裸鼠，取肝製成冰凍切片，雷射共聚焦細胞儀檢測，結果見圖3。實驗結果表明幹細胞誘導因子對肝臟疾病的具有良好的治療作用，在造血幹細胞向肝細胞轉化過程中幹細胞誘導因子具有明顯的促進作用，可阻止肝細胞壞死，肝細胞DNA的合成明顯加快，促進肝細胞再生的作用，加速肝臟組織的修復。
實施例5胚胎豬肝來源的幹細胞誘導因子取新鮮胚胎豬肝，用無鈣鎂HBSS緩衝液肝臟灌流，剪切成小塊(1-3mm2)研磨，離心後經截留分子量小於20kD的濾膜過濾，濾液經濃縮凍幹，用Sephadex LH20層析柱製備層析分離分子量0.8-11kD的組分，以DEAE離子交換層析分離。冷凍乾燥後，無菌分裝。
每批含量和活性由藥典標準方法測定。
無菌提取的胚胎幹細胞或幹細胞克隆來源的幹細胞，靜注給予治療107個/60kg後治療組給予肌注或靜注幹細胞轉化因子100ug/kg一日一次，10-14天為一療程。
治療效果鑑定可見肝臟幹細胞增殖並有分化趨勢，臨床檢測各肝功能逐漸恢復。
質量標準及臨床應用均同前。
實施例6新生牛來源的幹細胞誘導因子取健康未哺乳新生牛的肝臟，用無鈣鎂HBSS緩衝液肝臟灌流，高速組織搗碎機搗碎，離心後經截留分子量小於20kD的濾膜過濾，濾液，用Sephadex LH 20層析柱製備層析分離分子量0.8-11kD的組分，以離子交換樹脂層析分離。濃縮後凍幹，無菌分裝，即得。
實施例7新生豬肝來源的幹細胞誘導因子取新生健康未哺乳豬的肝臟，經處理後，在勻漿器中勻漿(冰浴)，經截留分子量小於20kD的濾膜過濾，用Sephadex LH 20層析柱製備層析分離分子量0.8-11kD的組分，以DEAE離子交換層析分離，5ml/min流速上樣，收集0.5M NaCl處洗脫液，製成無菌水溶液，4℃以下保存，即得。
質量標準及臨床應用基本同前。
權利要求
1.一種幹細胞複合藥物，包括幹細胞和肝細胞誘導因子；其中所述的幹細胞是以人或其他哺乳動物的胚胎、臍帶血、脊髓為原料，採用免疫磁珠陽性篩選製備的幹細胞；所述的肝細胞誘導因子由哺乳類動物胚胎或幼體肝臟中提取經層析方法分離、純化的具有生物學活性的小分子量多肽，分子量為0.8-6KD，優選1.2-6KD；
2.根據權利要求1所述的一種幹細胞複合藥物，其製備方法包括如下步驟1)將原料稀釋得到稀釋液；2)單核細胞的獲得；3)免疫磁珠陽性篩選。
3.根據權利要求2所述的一種幹細胞複合藥物，其製備方法的步驟1)中的原料稀釋為以20ml枸櫞酸-枸櫞酸鈉(簡稱ACD)和葡萄糖(簡稱CB)的PBS緩衝溶液稀釋臍帶血或脊髓塊等，得到臍帶血或脊髓稀釋液；緩衝溶液中ACD∶CB＝1∶6，CB∶PBS＝1∶4。或將人或其他哺乳動物的胚胎勻漿後稀釋。
4.根據權利要求2所述的一種幹細胞複合藥物，其中步驟2)中通過下述方法獲得單核細胞按照Ficoll∶CB＝3∶7的量用Ficoll將脊髓或胚胎稀釋液分層，4℃800g離心30分鐘，收集界面層後，在4℃ 500g離心20分鐘，棄上清，得到脊髓單核細胞收集界面層。
5.根據權利要求4所述的一種幹細胞複合藥物，上還包括採用流式細胞儀分選幹細胞。
6.根據權利要求2所述的一種幹細胞複合藥物，其中步驟2)中通過下述方法獲得單核細胞按照Ficoll∶CB＝3∶7的量用Ficoll將臍帶血稀釋液分層，4℃ 800g離心30分鐘，收集界面層後，在4℃ 500g離心20分鐘，棄上清，將棄上清後的沉澱物用紅細胞裂解液4℃下裂解10分鐘，用PBS緩衝液洗滌細胞，300g離心20分鐘，採用流式細胞儀分選幹細胞，得到臍帶血的單核細胞(MNC)。
7.根據權利要求2所述的一種幹細胞複合藥物，步驟3)中的免疫磁珠陽性篩選為Dynabeads M-450 CD34洗滌，置於磁板(MPC)1分鐘，棄清液，PBS緩衝液洗滌2次，混合磁珠(MACS，Miltenyi公司產品)和臍帶血的單核細胞的CD34溶液，4℃微旋孵育30分鐘，陽性篩選CD34+細胞；玫瑰花環狀細胞—磁珠重新懸起，置於磁板(MPC)2分鐘，棄清液，重複3次，得玫瑰花環狀細胞—磁珠，懸於100μl PBS緩衝液；Detachabead CD34解離細胞，微旋孵育45分鐘，加2ml PBS緩衝液，混勻，置於磁板(MPC)2分鐘，收集細胞清液，重複3次，匯集細胞清液，置於MPC 2分鐘，除去殘留磁珠，將細胞清液移入錐形試管；離心、洗滌2次，細胞計數，流式細胞儀FACS檢測；其中MNC∶Dynabeads M-450 CD34∶Detachabead CD34＝4×108∶4×107∶4×107＝1ml∶100μl∶100μl。
8.根據權利要求1所述的一種幹細胞複合藥物，其特徵在於所述的肝細胞誘導因子的製備方法是取健康未哺乳新生牛、乳豬或乳羊等哺乳類動物的肝臟處理後，冰浴中在勻漿器勻漿，過濾組織碎片，超聲波細胞粉碎，高溫變性，醇沉，離心，取沉澱物溶於0.02M Tris-HCL，PH7.7，DEAE離子交換樹脂層析分離，或研磨、離心後經截留分子量小於20kD的濾膜過濾，濾液經濃縮凍幹，用Sephadex LH20層析柱製備層析分離分子量0.8-11kD的組分，以DEAE離子交換層析分離；0-0.7M NaCl連續梯度洗脫，收集0.5M NaCl處洗脫液，凍幹或製成無菌水溶液、顆粒劑、膠囊等，冷暗處保存。
9.根據權利要求1所述的幹細胞複合治療藥物，其特徵在於可製成注射用凍幹製劑、注射液、顆粒劑或膠囊劑型。
10.權利要求1所述幹細胞複合藥物的製備方法，包括(1).幹細胞的製備以20ml枸櫞酸-枸櫞酸鈉(簡稱ACD)和葡萄糖(簡稱CB)的PBS緩衝溶液稀釋臍帶血或脊髓塊等，得到臍帶血或脊髓稀釋液；緩衝溶液中ACD∶CB＝1∶6，CB∶PBS＝1∶4；或將人或其他哺乳動物的胚胎勻漿後稀釋。按照Ficoll∶CB＝3∶7的量用Ficoll將脊髓或胚胎稀釋液分層，4℃ 800g離心30分鐘，收集界面層後，在4℃ 500g離心20分鐘，棄上清，得到脊髓或或胚胎單核細胞收集界面層。用流式細胞儀分選幹細胞。免疫磁珠陽性篩選Dynabeads M-450 CD34洗滌，置於磁板(MPC)1分鐘，棄清液，PBS緩衝液洗滌2次，混合磁珠和臍帶血的單核細胞的CD34溶液，4℃微旋孵育30分鐘，陽性篩選CD34+細胞；玫瑰花環狀細胞—磁珠重新懸起，置於磁板(MPC)2分鐘，棄清液，重複3次，得玫瑰花環狀細胞—磁珠，懸於100μl PBS緩衝液；Detachabead CD34解離細胞，微旋孵育45分鐘，加2ml PBS緩衝液，混勻，置於磁板2分鐘，收集細胞清液，重複3次，匯集細胞清液，置於MPC 2分鐘，除去殘留磁珠，將細胞清液移入錐形試管；離心、洗滌2次，細胞計數，流式細胞儀FACS檢測。其中MNC∶Dynabeads M-450 CD34∶Detachabead CD34＝4×108∶4×107∶4×107＝1ml∶100μl∶100μl；(2).肝細胞誘導因子取健康未哺乳新生牛、乳豬或乳羊等哺乳類動物的肝臟處理後，冰浴中在勻漿器勻漿，過濾組織碎片，超聲波細胞粉碎，高溫變性，醇沉，離心，取沉澱物溶於0.02M Tris-HCL，DEAE離子交換樹脂層析分離，或研磨、離心後經截留分子量小於20kD的濾膜過濾，濾液經濃縮凍幹，用Sephadex LH 20層析柱製備層析分離分子量0.8-11kD的組分，以DEAE離子交換層析分離；0-0.7M NaCl連續梯度洗脫，收集0.5M NaCl處洗脫液，凍幹或製成無菌水溶液、顆粒劑、膠囊等，冷暗處保存，即得。
全文摘要
本發明涉及一種幹細胞複合藥物、其製備方法及其在用於治療各種肝病藥物上的應用，所述幹細胞複合藥物包括幹細胞和肝細胞誘導因子；其中所述的幹細胞是以人胚胎、臍帶血、脊髓等為原料，採用免疫磁珠陽性篩選製備的幹細胞；所述的肝細胞誘導因子由哺乳類動物胚胎或幼體肝臟中提取經層析方法分離、純化的具有生物學活性的小分子量多肽；使用時二者協同作用，促進異源幹細胞在肝臟的存活及向肝臟細胞的轉化。
文檔編號A61K35/54GK1397344SQ0212363
公開日2003年2月19日 申請日期2002年7月2日 優先權日2001年7月2日
發明者韓梅, 王寧, 李凌松, 黃小華 申請人:北京北醫基因科技投資有限公司