用於製備無細胞有機組織的方法和設備的製作方法

2023-04-28 18:49:06

專利名稱：用於製備無細胞有機組織的方法和設備的製作方法
用於製備無細胞有機組織的方法和設備
本發明涉及製備用於再生(revitalisation )的無細胞有機組織的方 法，以及實施該方法來製備用於再生之組織的設備。
眾所周知，在醫學領域中，更具體而言在外科領域中，越來越重要 的是擁有可用於移植至活體的組織，以滿足對置換部分器官或完整器官 的日益增長的需求。
在實驗室製備生物學替代物並移植至動物或人類受體是一種被稱 為"組織工程"的醫學過程。
根據一種已知的技術，在實驗室中通過將細胞植入基質中來製備用 於移植的組織，所述基質由通稱為"支架"的無機支持介質構成。
用於補償受治器官的物質損失的"支架，，有利於細胞的三維組織， 直到完全形成新組織。
支架必須隨後自然發生降解過程，直至其完全消失，並被所述支架 中所植入的細胞形成的再生組織代替。
可以使用該方法獲得移植物，其中使用人工或者可得自人類或動物 的天然支架(即，從"供體"得到)，比如食管壁。
為了將從供體獲得的天然支架移植至另一個人，該組織必須首先經 過處理，以將所有存在於結締組織纖維之間的細胞去掉，然後再植入屬 於該移植物預定受者("宿主")的人細胞，以避免排斥現象。
以從供體獲得組織為起點的支架(即無細胞基質)製備技術已為人 所熟知，因此不在此詳細描述；簡言之，它們包括將待處理的組織浸泡 於包含酶類物質的液體中，這些酶類物質能夠消化和破壞組織中包含的 活細胞，而不損傷組織的結締組織。
在製備了可容納得自宿主的細胞的無細胞組織基質或支架之後，將 該組織或支架在所謂的"培養皿"(或類似容器)中進行製備，所述培 養皿是一種生物實驗室中常用的盤，將待再生的組織置於其底部。如下對組織進行再生植入未來受體的幹細胞，並用可培養該細胞 的細胞培養液為細胞提供養分，保持它們存活，使它們能夠增殖和分散。
基本上，最初放置於組織上表面的幹細胞移動通過支架組織中的天 然間隙一一之前被供體細胞佔據的間隙。
在經過給定的時間之後，在受控的溫度下並在培養液中的營養物質 存在下，活細胞將其自身重新安置在組織間隙中，其後該組織可用於移 植入受體器官中。
必須指出，通常用於使支架再生的細胞是幹細胞，其隨後開始分化 (或者可能已經分化)並獲得移植有該再生組織之器官的特定功能。
移植通過這種方法所製備組織的成敗取決於細胞在組織基質中的 毛細擴散。
如果這種擴散困難，或在表面而不是向深處進行，則移植的組織未 充分再生，壞死過程開始，導致移植失敗。
基於上述考慮，很明顯，確保組織的每一部分向深處再生(尤其是 在其整個厚度上)對於成功而言即便不是必不可少，也是非常重要的。
目前，即便將製備和再生處理應用足夠長的時間，仍然無法確保結 果可靠到足以保證不會發生任何移植失敗。
這是由於支架中所植入活細胞的穿透不足。
從實踐上講，這一缺點嚴重限制了製備適於移植的組織的機會，這 是由於較厚的組織在移植後未完全再生，因為它們不能被穿透至足夠的 深度。
因此，很明顯，目前的技術僅適於移植厚度非常有限的組織，比如， 不超過約O.lmm。
本發明的目的是開發一種製備克服了上述缺點的無細胞組織的方法。
更具體而言，本發明的目的是開發一種用於製備無細胞有機組織的 方法，使得在用幹細胞對該組織進行再生時，所述細胞更易於穿透並在結締組織纖維網絡的所有可能的空間定殖，以基本上重現與組織失活之 前相同的環境。
本發明的另一目的是，顯著和重要地減少加入活細胞後再生無細胞 支架以製備移植組織所需的處理時間。
本發明的目的通過權利要求1所述製備無細胞有機組織的方法來實現。
更準確的說，該方法包括在所製備組織的表面上產生多個孔；這些 孔至少穿透部分厚度，優選地穿透該組織的全部厚度。
這些孔是通過含有針的裝置來獲得，其中通過適當的電流，但不在 在所產生孔周圍的結締組織中誘發任何改變(撕裂、壞死、厚度減少或 增加、液體含量改變或者凝固)。
可以通過多種裝置和方法來產生穿入組織厚度的這些孔，只要這些 孔的製備過程不對孔周圍的結締組織和支架整體產生任何損害即可。
基於以下描述，本發明的目的以及就組織中所製備孔的質量而言的 最佳結果可通過以下步驟實現對用於製備每個孔的每個針的尖端施加 高頻電壓(一般為4MHz)，以引起弱電流通過，但其強度足以打開結 締組織中分子之間的鍵，從而造成孔，但不引起任何分子斷裂。
這產生直徑狹窄的孔，基本上與所插入針的規格相當。
重要的是使用規格非常窄(例如50pm的級別)但是足以幫助細胞 穿入所述孔內而使周圍組織再生的針。
合乎邏輯並且很明顯的是，產生大量的孔意味著為移植細胞進入組 織最深處提供了新的途徑，從而保證該組織的完全再生。
應用本發明的方法，對可製備用於移植之組織的厚度實際上沒有限 制，因為孔可以製成貫穿組織的厚度並遍布其整個表面，從而由於再植 到無細胞支架中的活細胞可以穿透整個組織而保證其完全再生。
本發明還包括用於實施製備本發明所述有機組織的方法的設備，其 主要特徵描述於權利要求11中。本發明的更多特徵和具體特點將在對本發明優選實施方案(在本文 中作為非限制性實例提供)以及用於實施該方法的相應設備的描述中更 詳細地凸顯出來。
下文藉助於附圖
描述本發明，其中
圖l顯示了包含帶有針陣列之固定器的設備的橫截面圖，所述針陣 列置於準備用於再生之組織的厚度上；
圖2顯示固定器中的一根針；
圖3顯示針陣列的布局；
圖4顯示用於移動針固定器的設備的示意圖。
根據本發明，將之前經處理的無細胞有機組織(所謂的支架)置於 培養亞(或類似的容器)底部，以使其在一個平面上展開。
將多個針(比如圖2中標記l所指的針)排列成陣列，比如形成圖 3中標記3所指的正方形，以確保針的有序排列，優選以相同距離分開 (即，彼此距離相等)。
每根針1的頭部11是電連通的，比如通過與所述針陣列的固定器 20相連的金屬導體盤2。
該盤2與電線21連接，從而接受發生器4的輸出。
該發生器4是電壓發生器，優選產生200-230伏特，但波頻為4MHz， 其使用電路獲得，這是公知的，為了簡潔起見在本文中不再描述。
在發生器4的輸出41可提供的電壓正弦波優選為失真正弦波，因 此至少具有一次、二次和三次諧波。
將發生器4的功率調整成使每個電極1尖端的電流為2到2.5mA。
如前所述，當每個針的尖端被放置於有機組織5的表面51上時， 每根針1的尖端和有機組織的接觸允許通過約2-2.5mA的電流。
該電流將能量傳遞至周圍的分子，其對應於(通過實驗證明)所謂 的"分子共振"。這一能量剛好足以使電流通過所影響的分子之間的鍵斷裂，而在周 圍區域不造成斷裂、撕裂、壞死、厚度減少或增加、流體含量變化、凝 固或其他組織變性。
基本上，這種在分子鍵之間造成的開口相當於產生了小孔，在實踐
中其直徑與每根針l相等，即約50-55nm。
當然，也可以使用不同的更大或更小規格的針，只要使用者銘記針 的最小規格不能小於用於再生的細胞的直徑即可。
接著以足夠慢的速度沿著針的指向推動針陣列3的固定器20，以使 針在前進時針尖能夠找到已經由於電流流過及其後分子鍵斷裂所產生 的孔。
容易看出，這樣不會撕裂結締組織，從而獲得了與插入針的規格相 當的窄孔。
如前所解釋，這是尤其重要和有用的，因為這樣再植到組織中的細 胞可以完全穿透整個組織的深度並移植到孔壁上，它們在這裡增殖並且 非常迅速地使全部厚度的有機組織再生。
如圖l所示，針l優選(但不必須)斜插到固定器5的表面51上， 以增加孔的長度並且因此在支架中獲得最大的通道效應。
實驗證明，與垂直成60。角在再生過程中更有效，因為所產生的孔 比支架的厚度更長。
實驗室檢測表明，含有針1的針陣列3的有用大小為lcm2，該陣列 含有約200根針；在這種情況下，發生器4產生的電流不超過500mA。
穿孔步驟必須在支架表面自然地重複進行，以使孔在待移植組織的 全部厚度和整個可用表面上均勻分布。
為此，本發明包括用於穿孔的設備，其有利地具有用於沿三個笛卡 爾軸(即沿著垂直或傾斜軸Z,以及沿著與表面51的平面平行的笛卡 爾軸X和Y軸)移動固定器20的裝置30，如圖4所示。
一旦在支架5的特定區域產生了孔，就可以移開固定器20，有序地 重複這一過程以覆蓋整個表面51。很明顯，如果攜帶針陣列3的固定器20與可編程的移動裝置(比 如由電控單元控制的步進馬達)連接，就可以自動有序地重複該過程， 並具有卓越的精確度。
如前述在無細胞組織5中完成一系列孔之後，很明顯，可將該無細 胞組織置於培養亞或相似的容器中，接著可向其中加入活細胞，通常是 從準備接受移植物的宿主個體獲得的幹細胞。
用培養液適當地培養後，千細胞可以迅速並容易地佔據所有用針1 製備的孔，從而保證用於移植的整個組織完全有效的再生。
很明顯，本發明的方法及其實施設備實現了本發明設定的所有目 標，因為確保了完美有效的再生並防止了後續移植的任何失敗風險。
此外，再生過程比使用已知技術時更為迅速，結果極為成功。
當任何權利要求中提到技術特徵之後帶有附圖標記時，這些附圖標 記的唯一目的是使權利要求更易於理解，因此在解釋這些附圖標記所示 例的每一要素時這些附圖標記不具有任何限制作用。
9
權利要求
1.製備用於通過植入活細胞而進行再生的無細胞有機組織的方法，其特徵為它包括下列步驟-在基本平坦的表面上製備所述無細胞組織；-在該組織的表面上產生多個孔，其遍布整個所述表面並且至少穿透該組織的部分厚度，所述孔適於容納再植進來的所述活細胞。
2. 權利要求l的方法，其特徵在於，所述多個孔是通過與電源相 連的一個或多個金屬針產生的，所述電源在每個針的尖端形成電流，其 強度和波形使得所提供的能量足以使所述針的尖端附近的有機組織所 包含分子之間的鍵斷裂，每個孔均由所述電流產生，並且其大小足以使 所述針的尖端進入由於所述分子鍵打開而形成的空間。
3. 權利要求1或2的方法，其特徵在於，通過基本為正弦波形且 頻率約4MHz的交流電為所述一個或多個金屬針提供電力。
4. 權利要求3的方法，其特徵在於，提供給所述一個或多個金屬 針的電力具有至少達三次的諧波。
5. 權利要求3或4的方法，其特徵在於，對所述一個或多個金屬 針施加的電壓為200-300伏特。
6. 權利要求3的方法，其特徵在於對每個金屬針施加的電流為 2國2.5mA。
7. 前述權利要求中任一項的方法，其特徵在於，所述孔的深度對 應於該有機組織的整體厚度。
8. 權利要求1至6中任一項的方法，其特徵在於，所述孔的長度 大於該無細胞有機組織的厚度。
9. 權利要求1至7中任一項的方法，其特徵在於，所述多個孔以 與該組織的表面基本垂直的方向排布。
10. 權利要求8的方法，其特徵在於，所述多個孔傾斜於該有機組 織的表面。
11. 適於在無細胞有機組織的表面上產生適於容納用於再生該組織 之細胞的一個或多個孔的設備，其特徵在於該設備包含-排列在固定器(20)中的一個或多個金屬針(1);-與所述一個或多個針相連的電功率源(4)，其適於向每個針的尖 端傳遞電流，其強度和波形使得所提供的能量足以使該有機組織中與該 針尖端相接觸的分子之間的鍵打開。
12. 權利要求ll)的設備，其特徵在於該電源由產生頻率約4MHz 且基本為正弦波形之電壓的發生器構成。
13. 權利要求12)的設備，其特徵在於該正弦波電壓具有至少達三 次的諧波。
14. 權利要求ll)的設備，其特徵在於為所述每個針提供的電流為 2-2.5mA。
15. 權利要求ll)的設備，其特徵在於包含排列在固定器(20)中 的多個針，其適於形成彼此基本平行的針陣列(3)，所述針之間基本上 等距。
16. 權利要求ll)的設備，其特徵在於所述至少一個針的規格為至 少50-55 ji m。
17. 權利要求ll)的設備，其特徵在於所述至少一個針的規格大於 再生細胞的最大尺度。
18. 權利要求15)的設備，其特徵在於所述針與所述固定器(20) 基本垂直。
19. 權利要求15)的設備，其特徵在於所述固定器(20)定位成傾 斜於待穿孔有機組織的表面。
20. 權利要求ll)的設備，其特徵在於它包含裝置(30),其沿著 與該組織表面交叉的至少一個軸以及沿著與該組織表面平行的至少一 個軸移動所述至少一個針。
21. 權利要求20)的設備，其特徵在於該移動裝置引起沿著與該有 機組織表面基本平行的兩個笛卡爾軸進行移動。
全文摘要
本項發明涉及製備通過再植活細胞來實現再生的無細胞有機組織的方法，該方法包括下列步驟在基本平坦的表面上製備無細胞組織，在該組織的表面上產生多個孔，其分布於整個所述表面上，並排布成至少穿透該組織的部分厚度。所述孔適於包含再植的活細胞。本發明還包括用於實施所述方法的設備，其特徵在於包含-排列在固定器(20)中的一個或多個針；-與所述一個或多個針相連的電功率源(4)。
文檔編號A61M37/00GK101687064SQ200880018213
公開日2010年3月31日 申請日期2008年4月16日 優先權日2007年5月31日
發明者毛裡齊奧·馬爾扎羅 申請人:毛裡齊奧·馬爾扎羅