一種白刺鬆散型胚性愈傷組織的誘導方法
2023-05-13 22:54:11 1
專利名稱：一種白刺鬆散型胚性愈傷組織的誘導方法
技術領域：
本發明屬於農業和植物育種領域，尤其是一種白刺鬆散型胚性愈傷組織的誘導方法。
背景技術：
白刺屬(Nitraria L.)，灌木，蒺藜科，全世界有12個種，我國有8個種，主要分布在乾旱荒漠地帶，其果實富含多種維生素和胺基酸，具有較高的藥用和食用價值。據調查，白刺有雄性不育現象，且種間雜交混亂，分化嚴重，果實在大小、色澤和味道等方面都存在著很大的差異。因此，進行白刺離體繁育技術研究，對野生白刺資源良種選育及資源開發具有十分重要的現實意義。由於白刺受制於本物種的遺傳資源，一些新的優良性狀不能產生，而一般的誘變育種又效率極低，很難誘變出新的優良性狀，雖然基因轉化技術可以將目的基因導入到白刺基因組，但由於轉基因植物很難環境釋放，因此該技術也只停留在實驗室階段。白刺體細胞離體誘變克隆技術的研究可以為白刺育種提供一條新的途徑，從而豐富白刺種質資源，為白刺的推廣利於奠定基礎。進行體細胞誘變克隆育種的基礎就是建立高效的單個體細胞離體再生體系，而胚性愈傷組織是最適合的誘變對象，其主要優勢在於:一是胚性愈傷細胞處於旺盛分裂狀態，細胞內的遺傳物質十分活躍，極易產生變異，這種現象在外加誘變劑的條件下表現更為明顯；二是胚性愈傷組織細胞在數量上有明顯的優勢，其每個細胞都可被看成單個的誘變對象，從而增加了誘變效率；三是胚性愈傷組織可以分散為多個獨立的個體，如採用細胞液懸浮培養技術獲得的每個突變植株 都是由單個的獨立的胚性變異細胞分裂、分化形成的，從而避免了常規誘變下出現的嵌合體現象。
發明內容
本發明的目的是克服現有技術的不足，提供一種白刺鬆散型胚性愈傷組織的誘導方法，從而提高利用愈傷組織進行的白刺體細胞誘變克隆育種的效率。本發明實現目的的技術方案如下:—種白刺鬆散型胚性愈傷組織的誘導方法，步驟如下:⑴剪取白刺無菌苗兩葉片間的莖段，接種到1/2MS+0.5-1.0mg/L 2，4-D+lOOmg/LVc+20g/L蔗糖的培養基上進行鬆散型愈傷組織的誘導，培養條件為23-25°C，每天光照12小時，光照強度為500-10001ux ；⑵2-3周後，將誘導出的鬆散型白刺愈傷組織接種到MS+2.0-3.0mg/LΚΤ+0.25-0.5mg/L 2，4_D +100mg/L Vc+30g/L蔗糖的培養基上進行胚性愈傷的誘導，培養條件為18-22°C，每天24小時光照，光照強度為1000-20001UX，在從鬆散型愈傷組織向胚性愈傷組織的誘導過程中，每5-8天繼代一次，繼代過程中，轉移愈傷塊；⑶當繼代4-5次後，鬆散的白刺愈傷組織開始轉變為較硬的愈傷，而且顏色從白色透明狀逐漸過渡到乳白色、黃色，最後為嫩綠色，此時的愈傷組織從結構上看由許多球狀體構成，結構鬆散，當以上特徵愈傷出現時，白刺的胚性愈傷組織誘導完成。而且，所述轉移愈傷組織塊的大小控制在2-3_3。而且，所述愈傷組織塊選擇的是愈傷組織外圍部位的組織作為下一次繼代培養的外植體。本發明的優點和積極效果是:1、本發明採用鬆散型胚性愈傷組織的誘變育種方式，鬆散型胚性愈傷組織的優勢如下:首先，鬆散的胚性愈傷組織易於分離，可以直接用於懸浮的胚性愈傷細胞的培養，簡化了在液體培養時通過反覆的繼代培養來獲取分散度均勻的細胞系的程序；其次，鬆散的胚性愈傷組織在進行培養、繼代過程中，由於其結構鬆散，愈傷團細胞間留有充足的空間，可以避免愈傷組織內部細胞由於氧氣及營養等供應不良而導致的提前老化，導致只有愈傷組織團塊外圍的少量細胞處於活躍狀態，使得供試材料減少，影響下一步的試驗效果；第三，鬆散型胚性愈傷組織在進行誘變育種或在其它研究中，由於其細胞結構鬆散，使每個細胞都處於相同的的處理或生理生長狀態，可以保證試驗處理的均等性或同一性；第四，鬆散型胚性愈傷組織從細胞數量來看，處於胚性階段的細胞要明顯多於緊密型愈傷組織，因為緊密型愈傷內部由於營養不足及氣體交換的困難，使其細胞的生理狀態受到嚴重影響，多數細胞已不具備胚性細胞的功能，如仍然以其作為誘變材料的話，只能取其愈傷組織外圍的很少量的細胞進行有效的誘變及再生，其餘的絕大多數細胞均老化、死亡；從而，使誘變效率降低。·2、本方法通過對白刺胚性愈傷組織的誘導，建立了標準的白刺鬆散型胚性愈傷組織的誘導體系，為以後採用體細胞誘變育種技術培育白刺新品種奠定了基礎，也為其它植物品種胚性愈傷組織的誘導提供了參考。
:圖1為本發明誘導出的鬆散型白刺胚性愈傷組織；圖2為本發明鬆散型白刺胚性愈傷組織再生出芽；圖3為本發明初步誘導出的鬆散型半透明白色的白刺愈傷組織。
具體實施例方式下面結合實例，對本發明進一步說明，下述實例是說明性的，不是限定性的，不能以下述實例來限定本發明的保護範圍。一種白刺鬆散型胚性愈傷組織的誘導方法⑴取白刺實生苗一年生嫩枝，用40%的安替福民消毒處理後接種到1/2MS培養基上進行無菌苗的培養與繼代；⑵剪取白刺無菌苗兩葉片間的莖段(不帶葉片)，接種到1/2MS+0.5mg/L (2，4_D)+100mg/L (Vc) +20g/L蔗糖的培養基上進行鬆散型愈傷組織的誘導，培養條件為25°C，每天光照12小時，光照強度為lOOOlux。其中Vc是在培養基融化後處於50°C時加入，Vc為提前抽濾滅菌。⑶三周後，將誘導出的鬆散型白刺愈傷組織接種到MS+2.0mg/L (KT) +0.25mg/L(2，4-D ) +100mg/L (Vc) +30g/L蔗糖的培養基上進行胚性愈傷組織的誘導，培養條件為18-22°C，每天24小時光照，光照強度為20001UX。在從鬆散型愈傷組織誘導向胚性愈傷組織誘導的過程中，每7天繼代一次，繼代過程中，轉移愈傷組織塊的大小控制在3mm3，儘量選擇愈傷組織外圍部位作為下一次繼代培養的外植體。⑷當繼代培養4次後，鬆軟的白刺愈傷組織開始轉變為較硬的愈傷組織，而且顏色從白色透明狀逐漸過渡到乳白色、黃色，最後為嫩綠色，此時的愈傷組織從結構上看基本由無數極小的球狀體構成，且其結構十分鬆散，極易分散開來。當以上特徵愈傷組織出現時，標誌著誘導過程完成，即白刺的胚性愈傷組織誘導成功，可以利用其進行進一步的研究及應 用。
權利要求
1.一種白刺鬆散型胚性愈傷組織的誘導方法，其特徵在於:步驟如下: (1)剪取白刺無菌苗兩葉片間的莖段，接種至IJ 1/2MS+0.5-1.0mg/L 2，4-D+100mg/LVc+20g/L蔗糖的培養基上進行鬆散型愈傷組織的誘導，培養條件為23-25°C，每天光照12小時，光照強度為500-10001ux ； ⑵2-3周後，將誘導出的鬆散型白刺愈傷組織接種到MS+2.0-3.0mg/LΚΤ+0.25-0.5mg/L 2，4_D +100mg/L Vc+30g/L蔗糖的培養基上進行胚性愈傷的誘導，培養條件為18-22°C，每天24小時光照，光照強度為1000-20001UX，在從鬆散型愈傷組織向胚性愈傷組織的誘導過程中，每5-8天繼代一次，繼代過程中，轉移愈傷塊； ⑶當繼代4-5次後，鬆散的白刺愈傷組織開始轉變為較硬的愈傷，而且顏色從白色透明狀逐漸過渡到乳白色、黃色，最後為嫩綠色，此時的愈傷組織從結構上看由許多球狀體構成，結構鬆散，當以上特徵愈傷出現時，白刺的胚性愈傷組織誘導完成。
2.根據權利要求1所述的白刺鬆散型胚性愈傷組織的誘導方法，其特徵在於:所述轉移愈傷組織塊的大小控制在2-3mm3。
3.根據權利要求1所述的白刺鬆散 型胚性愈傷組織的誘導方法，其特徵在於:所述愈傷組織塊選擇的是愈傷組織外圍部位的組織作為下一次繼代培養的外植體。
全文摘要
本發明涉及一種白刺鬆散型胚性愈傷組織的誘導方法，步驟如下⑴剪取白刺無菌苗兩葉片間的莖段，接種到培養基上進行鬆散型愈傷的誘導；⑵2-3周後，將誘導出的鬆散型白刺愈傷組織接種到培養基上進行胚性愈傷組織的誘導，在從鬆散型愈傷組織到胚性愈傷組織的誘導過程中，每5-8天繼代培養一次，繼代培養過程中，轉移愈傷組織塊；⑶當繼代培養4-5次後，鬆軟的白刺愈傷組織開始轉變為較硬的愈傷組織，而且其顏色從白色透明狀逐漸過渡到乳白色、黃色，最後為嫩綠色，此時的愈傷組織從組織結構上看為許多球狀體構成的鬆散結構。當以上特徵愈傷組織出現時，就完成了白刺的胚性愈傷組織的誘導。本方法通過對白刺胚性愈傷組織的誘導，建立了標準的白刺鬆散型胚性愈傷組織的誘導體系。
文檔編號A01H4/00GK103238517SQ20131011890
公開日2013年8月14日 申請日期2013年4月8日 優先權日2013年4月8日
發明者楊靜慧, 劉豔軍, 黃俊軒, 李建科, 武春霞 申請人:天津農學院