測定銀杏葉組合物中萜內酯含量的方法

2023-05-13 10:49:21

專利名稱：測定銀杏葉組合物中萜內酯含量的方法
技術領域：
本發明涉及植物藥製劑，具體涉及一種銀杏葉組合物及其製備方法與應用。
銀杏(Ginkgo Biloba)是現存種子植物中最古老的一種，也是可上溯到2億多年前二疊紀時的銀杏家族的唯一倖存者。在中國，銀杏葉製劑用於治療已有5000多年了，也就是說，從中草藥的最早起源就開始用於治療了。自六十年代以來，銀杏葉的植藥提取物在很多國家用於治療腦血管及周圍血管疾病，如德國、法國、日本和韓國。
背景技術：
銀杏葉中的主要有效成份是黃酮類化合物，它包括至少14種不同的化合物，例如黃酮醇、黃酮、黃烷酮和雙黃酮等等，這些化合物中，黃酮苷和黃酮醇苷包括山萘素、槲皮素和異鼠李素與葡萄糖或鼠李糖結合物，是市場上用於治療目的的銀杏葉提取物(Tebonin、Tanakan、Roekan或「EGb761」)中最顯著的組分，實驗表明黃酮苷和黃酮醇苷為有力的抗氧劑，可清除氧自由基從而避免由於年齡老化而引起的細胞和組織損傷，它們會嚴重影響大腦功能，包括記憶力和注意力，參見J.Pincemail等人，La Presse Medicale Vol.15(1986)，1475-1479；J.Robak等人，Biochem Pharmacol Vol 37(1988)，837-841和J.Kleijnen與 P.Knipschild Ginkgo biloba(Drug Profiles)，the Lancet3401136(1992)，另外，黃酮苷和黃酮醇苷也可改善周圍血管循環，含有高濃度活性成分黃酮苷的銀杏葉提取物的製備工藝在(專利)DE-B1767 098和DE-B 21 17 429中都有描述，這些製備物為銀杏葉單一成份提取物。
除黃酮外，銀杏葉中另一主要活性成份是萜內酯，包括銀杏內酯A、B、C、J、M和白果內酯，銀杏內酯為含有內酯結構的萜類，參見K.Nakanishi，Pure和Applied Chemistry，Vol.14(1967)89-113；M.Maruyama等人，Tetrahedron Letters(1967)，299-302及303-319和K.Okabe等人，Ginkgolides，J chem.Soc.(1967)，2201-2206，它們是20個碳的籠狀分子，含有一個叔丁基和六個5元環A至F，所述六個五元環包括一個螺[4.4}壬烷，一個四氫呋喃環和三個內酯環，不同銀杏內酯結構僅是螺壬烷骨架上C1，C3或C7上羥基數目和位置不同。最近發現，由於它們拮抗血小板活化因子(PAF)的特性，銀杏內酯A、B、C和M特別是白果內酯B能有效治療血小板活化因子誘發的疾病如哮喘、支氣管炎、老年性痴呆、過敏、心功能失調、風溼病等等以及其它循環系統疾病，參見美國專利號4,734,280；P.Braquet，Drug of the Future，12，643，1987；V Lamant等人，Biochem Pharmacol Vol.36(1987)2749-52；K.Becker等人，Biomed Biochim Acta Vol 47(1988)10-11；P.Braquet等人，J Ethnopharmacol Vol.32(1991)135-9和B.Steinke等人，Planta Med Vol 59(1993)155-60銀杏內酯A和B可增加腦血流量而對大腦起保護作用，參見J.Krieglstein等人，European Journal ofPharmaceutical Sciences Vol.3(1995)39-48，美國專利號5,002,965描述了一種使用銀杏內酯防止器官移植中排斥反應的方法。
DE-A 33 38 995和相關美國專利號4,571,407使用白果內酯，一種結構與銀杏內酯相關的倍半萜內酯，參見K.Nakanishi等人，R.T.Major等人和K.Weinges等人，J.Am.chem Soc.，Vol.93，1971，3544-3546治療腦病，腦水腫，脫鞘神經病和脊髓病，在中腦動脈閉合前使用白果內酯在梗塞部位，皮質和梗塞面積明顯減小，參見J.Krieglstein等人，European Journal of Pharmaceutical Sciences Vol.3(1995)39-48.實驗表明白果內酯有助於復原動物的運動神經，參見C.Bruno等人，Planta Med 59，1993，302-307。另外，體外和體內實驗證明白果內酯具有抑制卡氏肺囊蟲生長的特性，參見C.Atzori等人，Antimicrobe Agents Chemother 37(7)1993，1492-1496。美國專利號5,264,216採用白果內酯能治療下列病菌的某些感染陰道毛滴蟲、大腸桿菌、乳酸桿菌，卡氏肺囊蟲、金黃色葡萄球菌、類鏈球菌。白果內酯抗卡氏肺囊蟲感染活性主要用於治療愛滋病並發感染。
除上述化合物外，銀杏葉至少含有12種烷基酚酸化合物，包括銀杏酸(漆樹酸)，它是6-烷基水楊酸，烷基為正13碳到正19碳有0-3個雙鍵的烷基基團，參見J.L. Gellermann等人，Phytochemistry，Vol.15(1976)，1959-1961和Analytic.Chem.，Vol.40(1968)，739-743。同毒常青藤中刺激物結構相仿，銀杏酸是銀杏葉提取物毒性作用的因素，這些毒性作用包括胃腸道副作用、頭痛、皮膚刺激和水腫，六十年代以來，已有多例在接觸銀杏葉或果實後出現過敏反應的報告，參見G.A.Hill等人，J.Am.Chem Soc.，Vol.56(1934)，2736-2738，W.F.Sowers等人，Arch，Dermatol.，Vol.91(1965)，452-456；L.E.Becker等人，J.Am.Med.Assoc.，Vol.231(1975)，1162-1163；T.Nakamura，Contact Dermatitis，Vol.12(1985)，281-282；R.R.Tomb等人，Contact Dermatitis，Vol.19(1988)281-3和J.P.Lepoittevin等人，Arch Dermatol Res Vol.281(1989)，227-30。於是，許多國家的科學家努力開發脫敏的物質和方法以對抗銀杏酸所致的過敏(參見美國專利號4,428,965)。DE-B 17 67 098和DE-B 21 17 429開發了一種採用氯代脂肪烴如四氯化碳來去除烷基酚化合物的工藝，然而在該工藝中相當多的有醫療價值的銀杏內酯和白果內酯也會失掉了。DE-B 21 17 429開發了一種技術以除去具有丹寧特性的多酚類化合物(原花色素)，在工藝中使用了鉛化合物。這些工藝的問題是可能危害操作人員的健康，對環境的潛在威脅以及藥品中有害的殘留物。
當前最常用的用於治療目的的銀杏葉提取物(Tebonin、Tanakan、Roekan或「EGb 761」)含有24％黃酮苷和6％萜內酯；參見K.Driau La Presse Medicale Vol.15(1986)，1455-1457，銀杏內酯A、B、C和J以及約佔這6％的一半的白果內酯，銀杏葉提取物通常含有低於10ppm烷基酚化合物，每日治療劑量120mg。
在九十年代，盡了很大的努力增加銀杏葉提取物中活性成分的含量並減小銀杏酸的濃度，同時，也探討了為不同治療提供不同銀杏葉提取物有效成份特定組合的可能性。銀杏內酯和黃酮苷的組合可使提取物的活性轉向抗PAF作用。相反，白果內酯和黃酮苷的組合對治療腦病、腦水腫、脫鞘神經病、脊髓病更具活性，同時也開發了不使用氯代脂肪烴去除烷基酚和不使用鉛去除原花色素的方法。
美國專利號5,399,348提及到一種銀杏葉提取物的製備方法，它不採用氯代脂肪烴分離烷基酚化合物，而是首先通過一沉澱過濾工序，然後從脂肪烴進行多步液液萃取，使用鉛化合物或聚醯胺以去除原花色素。該方法如下銀杏葉以一種有機溶劑如丙酮水溶液，一至三個碳的醇水溶液或無水甲醇提取，分離大部份有機溶劑後得到一水溶液，然後用水稀釋至固體含量(含固量)5-25％(重量)。稀釋後的水溶液冷卻沉澱以去除親脂性組分，然後以硫酸銨處理並用甲乙酮、丙酮或甲乙酮、丙酮混合物萃取，萃取液以水和醇稀釋後得到一水醇溶液，再以鉛化合物或不溶性聚醯胺處理。處理後的水醇溶液最後再用一個脂肪烴或脂環烴溶劑萃取以進一步去除烷基酚化合物，最終得到一乾燥提取物。
另外，在以甲乙酮或甲乙酮、丙酮混合物萃取後，萃取液可被濃縮至含固量50～70％，然後以水和醇稀釋得到含固量10％(重量)含水、醇各50％(重量)的水醇溶液，然後將一種鉛鹽水溶液，乙酸鉛、鹼或乙酸鉛或硝酸鉛或氫氧化鉛水懸浮液，最好是鹼式乙酸鉛溶液加入到上述水醇溶液中，直到由顏色褐色轉為赭色，形成沉澱，並分離除去水醇溶液用脂肪烴或脂環烴溶劑萃取以進一步去除烷基酚化合物，然後濃縮至醇濃度不超過5％，加入硫酸銨至濃度為20％(重量)，得到的醇水溶液用比例為9∶1至4∶6的甲乙酮乙醇混合物萃取，形成一有機相萃取液，該相濃縮至固體含量50～70％後乾燥，除了鉛鹽也可用聚醯胺如聚醯胺6，聚醯胺66或交聯聚乙烯吡咯烷酮(Polyvidon)。
美國專利號5,399 348發現採用上述方法，所得銀杏葉製備物含黃酮苷20到30％，銀杏內酯A、B、C、J 2.5～4.5％，白果內酯2.0～4.0％，烷基酚化合物小於10ppm以及小於10％的原花色素。
美國專利號5,322,688開發了一種與上述相似的去除烷基酚化合物的工藝，但是與採用鉛去除原花色素不同，美國專利號5,322,688採用了萃取工藝，使用了不與水混溶的4或5個碳的醇如正丁醇。該方法的特點是銀杏葉以丙酮水溶液，一至三個碳的醇水溶液或無水甲醇提取，蒸發或蒸餾除去提取液中大部份有機溶劑，得到的水溶液以水稀釋至固體含量5-25％。稀釋後的水溶液冷卻、沉澱除去水不溶性的親脂成分，然後水溶液以10～30％硫酸銨處理並用甲乙酮或甲乙酮丙酮混合物萃取，萃取液以丁醇或戊醇萃取，丁醇或戊醇萃取液以水和醇稀釋，得到的水醇溶液再以脂肪烴或脂環烴溶劑萃取以進一步除去烷基酚化合物，最後濃縮水相溶液，所得濃縮物經乾燥後即得提取物。
另外，在上述用甲乙酮或甲乙酮丙酮混合物提取後，也可將提取液濃縮至固體含量50至70％，然後以水稀釋至固體含量10％(重量)，水濃縮液即用不與水混溶的C4或C5醇萃取，醇層濃縮至固體含量50至70％，該濃縮液以水和醇稀釋得到一含乾燥提取物5～20％的含醇20～60％(重量)的醇水溶液，將該溶液以脂肪烴或脂環烴溶劑萃取，以進一步除去烷基酚化合物，最後，濃縮水相濃縮物，經乾燥得乾燥提取物。
美國專利號5,322,688提出採用上述方法所得銀杏葉製備物含有黃酮苷20～30％，銀杏內酯A、B、C和J 2.5-4.5％，白果內酯2.0～4.0％，烷基酚類化合物低於10ppm以及小於10％的原花色素。
美國專利號5,389,370也採用了美國專利號5,322,688所描述的去除烷基酚化合物和原花色素的方法，但是提供了含高濃度活性成份以及它們的組合物的銀杏葉提取物的製備方法。美國專利號5,389,370的工藝的特點是含黃酮苷至少1.4％的銀杏葉以丙酮水溶液，最多三個碳的醇水溶液或無水甲醇提取，分離除去大部分有機溶劑直至濃度不大於10％，得到的經濃縮的水性溶液以水稀釋至固體含量15～20％(重量)然後放置冷卻直至沉澱生成，這些沉澱由不易溶於水的親脂性成分組成，經過濾除去，剩下的水溶液以甲酸酯或乙酸酯如乙酸乙酯或乙酸乙酯與一脂肪烴或脂環烴的混合物進行多步萃取，水相中溶解的酯可藉蒸餾完全除去，剩餘溶液以與水不相溶的C-4或C-5醇萃取，醇相以水洗滌，隨後濃縮，殘留的溶劑通過恆沸蒸餾完全除去，殘留物以40％(重量)醇水溶液稀釋生成一稀釋的殘留物。
另外，在上述工藝中，為去除乙酸乙酯或乙酸乙酯/烴萃取液中的提取伴隨物，可將萃取液用活性碳或矽膠柱層析處理。而且，上述工藝中乙酸乙酯或乙酸乙酯/烴混合得到的萃取液可首先用活性碳處理以除去伴隨的雜質，然後銀杏內酯結晶析出，純淨的白果內酯和剩餘的銀杏內酯通過柱層析從母液中分離。
在上述工藝中最後一步得到的稀釋後的殘留物可用脂肪烴或脂環烴溶劑進一步萃取以降低烷基酚化合物含量，水相濃縮蒸發後得到一乾燥提取物。
美國專利號5,389,370報告採用上述方法，得到銀杏葉製備物含黃酮苷40～60％；銀杏內酯A、B、C和J 5.5-8％而白果內酯5-7％，或銀杏內酯5.5～8％而白果內酯小於0.1％，或白果內酯5-7％而銀杏內酯不大於0.1％；原花色素0-10％以及最大濃度為10ppm的烷基酚化合物，優選其含量低於1ppm。
美國專利號5,637,302涉及到一種銀杏葉提取物的製備方法，在這裡銀杏葉粗提物用由正丁醇和甲苯組成的溶劑進行萃取從而避免了使用氯代脂肪烴和鉛化合物，此外，採用這一工藝也可解決其它發明中使用大量相互混溶的不同溶劑的問題。美國專利號5,737,302的工藝的特點如下，銀杏葉用一含水溶劑丙酮水溶液或甲醇和/或乙醇和水溶液提取，這些含水的提取液直接用正己烷或正庚烷或甲苯/丁醇混合物萃取以除去非活性親脂性物質如烷基酚和多元酚，脫脂後的溶液濃縮至一定體積即相當於生藥的重量，然後放入冰箱中24小時，然後離心，得到二聚類黃酮組成的半結晶物質，水相以體積比1∶2到1∶4的甲苯/丁醇逆流萃取。甲苯-丁醇相用水逆流洗滌後濃縮成浸膏樣並以水或水醇混合物洗滌，以進一步去除殘留的微量甲苯和丁醇，最後乾燥。
此外，脫脂後的水溶液仍含有一定比例的二聚黃酮，可使其通過吸附樹脂如一芳香族聚合物樹脂，它對酚有顯著的活性能很容易地吸附很多活性成分，被吸附的活性成分用有機溶劑如低級醇(C1-C4)或與水混溶的酮從樹脂上再洗脫。
美國專利號5,637,302發現採用上述方法，得到銀杏葉提取製備物含22～26％黃酮苷，2.5～4.5％銀杏內酯2.5～4.5％白果內酯，幾乎不含烷基酚化合物且原花色素小於10％。

發明內容
本發明的目的是進一步確定每一個黃酮類組份，提供更為精製的銀杏提取物，可測定其含量，調整它們之間的比例。這些單一的組份包括了黃酮醇，黃酮、黃烷醇及黃酮醇苷。產品的含量符合國家制定的藥物測試要求和組份重現性，不管銀杏葉原料中的各種組份有何不同。這種組份更確定的銀杏提取物聚集了有效的活性成份，減少了未知成份。具有更規範的生產工藝和質控標準。本發明提高了所製備的藥物的安全性，增強了醫生、病人用藥的信心和藥物篩選的重現性。
本發明的另一個目的是提供一種高含量的銀杏提取物，含量指標分別為黃酮類44-78％；銀杏內酯2.5-10％；白果內酯2.5-10％。高含量的銀杏提取物是許多國家藥物標準的要求，但由於這些條款僅適用提純的化合物，所以普通的提取物是難以滿足的。到目前為止還不可能製備如此高含量的銀杏提取物。
高含量提取物的另一個優點是減少了每天的用藥劑量，縮小了製劑的體積。服用銀杏製劑的大多數患者為老年人，所以這優點更為突出。
還有一優勢是高含量提取物大大地除去了非活性成份，大量去除非活性成份增加了用藥的安全性，更為簡化的活性成份使主要成份的測試及雜質的確定更為方便。提純的銀杏提取物可用於器官移植時抑制異體排斥反應。
該發明還有一個目的就是除去銀杏酸，消除過敏反應的發生。
因為現在的藥用銀杏提取物主要是用於治療腦及周圍動脈循環不良症，所以本發明還有一個目的是提供一種方法，使該方法能用於治療冠心病引起的心絞痛。
本發明所提供的銀杏浸膏含黃酮類44～78％，銀杏內酯2.5～10％，白果內酯2.5～10％，銀杏酸0.1～5ppm。
本發明涉及從銀杏葉中提取的組份，特別是包括含有新活性成份及其混合物的不同組份。提供了製備這些相同提取物的方法，鑑別及測定其含量的方法，還提供了含有這些活性成份和混合物的藥物及其應用於治療冠心病引起的心絞痛的方法。
本發明提供了一種組合物，包括黃酮類化合物約44％～78％，銀杏內酯2.5％～10％(包括銀杏內酯A、B、C和J或其混和物)，白果內酯2.5～10％和銀杏酸0.1～5ppm。
本發明提供了一種組合物，其中含有黃酮類化合物約44％～78％(其中包括黃酮醇、黃烷醇和黃酮苷)，銀杏內酯2.5％～10％(包括銀杏內酯A、B、C和J或其混和物)，白果內酯2.5～10％和銀杏酸0.1～5ppm。
本發明提供了一種組合物，含黃酮類化合物約44％～78％(其中黃酮苷20～75％)，銀杏內酯2.5％～10％(包括銀杏內酯A、B、C和J或其混和物)，白果內酯2.5～10％和銀杏酸0.1～5ppm。
本發明提供了一種組合物，含黃酮類化合物約44％～78％(其中黃酮苷與黃酮醇的比率為1～30∶1)，銀杏內酯2.5％～10％(包括銀杏內酯A、B、C和J或其混和物)，白果內酯2.5～10％和銀杏酸0.1～5ppm。
本發明提供了一種組合物，它含約44％～78％的黃酮類化合物(其中含有黃酮苷)，5～20％的內酯(其由2.5％～10％的銀杏內酯A、B、C和J的單一成分或其混合物，以及2.5～10％的白果內酯組成)，其中黃酮苷和內酯之比約3.5～4.5∶1，還含銀杏酸0.1～5ppm。
本發明提供了一種組合物，其中含有黃酮苷的黃酮類化合物不少於44％，其中含有銀杏內酯A、B、C和J的單一成分或其混和物的銀杏內酯不少於6％，並含0.1～5ppm的銀杏酸。
本發明提供的上述組合物中的銀杏酸含量約0.1～0.5ppm。
本發明提供的組合物，它的組成成分是從銀杏葉中提取的。
本發明提供的上述組合物，它的組成成分是從人工培養植物中獲得的銀杏葉中提取出來的。
本發明提供了一個獲得銀杏組合物的方法，步驟如下
(a)得到乾燥銀杏葉(b)把葉子粉碎成小片(c)用水、1～3個碳的脂肪醇、丙酮及其混合溶液對粉碎的葉子進行回流提取，在此條件下，使黃酮類化合物和萜烯內酯的提取成為可能，從而得到提取液和殘渣。
(d)將殘渣和提取液分離(e)60℃濃縮提取液至密度約1.2到1.25。
(f)步驟(e)中的濃縮液至少要用兩種樹脂處理，處理條件是能結合黃酮類化合物和內酯。
(g)洗脫結合有黃酮和內酯的層析柱，得到含有黃酮和內酯的銀杏提取物。
本發明提供了一個色譜法，即裝柱進行柱層析的色譜法。
本發明提供的色譜法的方法中採用的樹脂包括但並不限於多孔聚合物、矽膠、氧化鋁、聚醯胺、活性炭、纖維素和葡萄糖凝膠。
本發明提供的色譜法，其中柱用水，1～3個碳的脂肪醇、丙酮及其混合物或酯(甲酯或乙酯)洗脫。
本發明提供了鑑別和分析銀杏組合物中黃酮的方法，步驟如下(a)把組和物溶解在甲醇裡，製備供試品溶液。
(b)製備標準品溶液將銀杏葉標準品置於60％的乙醇水溶液中回流，然後過濾，蒸發乙醇，濃縮濾液，分別用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取濃縮的水溶液；濃縮正丁醇提取液至乾燥，再溶解在甲醇中。
(c)根據薄層色譜(TLC)方法進行分析在同一塊薄層矽膠板上將每一個上述提及的溶液點樣，用乙酸乙酯、甲酸、乙酸和水的混和液展開後，在空氣中乾燥，用1％氯化鋁的乙醇液噴勻，然後用365nm紫外光觀察，在標準樣品和供試樣品色譜圖上，可以在指定的位置看到8個黃色斑點。
本發明提供了一鑑別、分析銀杏組合物中萜烯內酯的方法，步驟如下(a)製備供試品溶液用乙酸乙酯回流銀杏組合物，然後過濾，濃縮濾液至乾燥，並溶解於甲醇。
(b)製備標準品溶液將銀杏內酯A、B、C、J和白果內酯等五個標準樣品溶解於甲醇，製成五份標準溶液。
(c)根據TLC方法進行分析在同樣的GF254薄層層析矽膠板上將上述提及的幾種溶液分別點樣，採用乙酸乙酯、甲苯、丙酮和環己烷的混和溶劑展開薄板，待展好之後，在空氣中乾燥，加熱，於254nm紫外燈下觀察，標準和試驗樣品在相同的位置出現相同顏色的斑點。
本發明提供了一個鑑別和分析檢查銀杏組合物中銀杏酸的方法，步驟如下(a)製備供試品溶液，將銀杏組合物用正己烷進行回流，然後過濾，濾液濃縮至幹並溶解於乙酸乙酯。
(b)製備標準樣品溶液將銀杏酸標準品溶解於乙酸乙酯。
(c)用薄層層析法進行分析在同樣的GF254薄層矽膠板上，取上述提及的溶液進行點樣，採用正己烷、乙酸乙酯和乙酸的混和溶劑展開薄板，在空氣中乾燥，於315和368nm紫外光下觀察，分析樣品溶液吸收應小於標準品溶液的吸收。
本發明提供了測定銀杏組合物中總黃酮的方法，步驟如下(a)製備標準品溶液將乾燥蘆丁定量溶於乙醇水溶液，得標準品溶液。
(b)繪製標準曲線吸取不同量的標準溶液至容量瓶，將每一容量瓶用水、乙酸-乙酸鈉緩衝液(pH＝4.5)、0.1M氯化鈉和70％的含水乙醇加至刻度，根據在270nm的吸收，繪製標準曲線圖。
(c)採用分光光度法分析樣品用70％乙醇溶解組合物樣品，吸取此溶液到一容量瓶，採用上述方法，製成樣品溶液，根據標準曲線，在270nm處測出樣品的吸收後就可得出其濃度，從蘆丁幹品計算出的總黃酮含量是標示量的85～115％。
本發明提供了測定銀杏組合物中黃酮苷的方法，步驟如下(a)製備供試品溶液用甲醇和25％鹽酸糖溶解樣品組合物，回流，除去鹽及不溶物，放置冷卻並轉移容量瓶，燒瓶用甲醇洗滌，洗滌液傾至容量瓶中，再用甲醇稀釋至刻度。
(b)標準液的製備將槲皮素、山萘素、異鼠李素溶解於同一容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度。
(c)用高壓液相的方法測定含量，計算槲皮素、山萘素、異鼠李素相對峰面積再通過下列公式計算總黃酮苷的含量＝槲皮素的量×2.50+山萘素量×2.63+異鼠李素的量×2.36。
本發明提供了測定萜稀內酯在銀杏提取物中的含量的方法，步驟如下(a)樣品溶液的製備該組合物用丙酮回流、過濾、濃縮濾液，殘渣溶解於乙酸甲酯中，用水萃取，水層用乙酸甲酯再萃取一次。合併兩份乙酸甲酯層，蒸乾後定溶於甲醇中。
(b)標準液的製備將內酯A、B。C、J和白果內酯用甲醇定溶於同一容量瓶中。
(C)測試供試液及標準液通過高壓液相色譜(HPLC)檢測，根據外標法算出A、B、C、J和白果內酯的含量，總內酯含量可藉求和得到。
本發明提供了用銀杏內酯A、B、C、J及白果內酯單體作為標準品來測試銀杏組合物中內酯含量的方法。
本發明提供了用銀杏酸單體作為標準品來測試銀杏組合物中銀杏酸含量的方法。
本發明提供了用蘆丁單體作為標準品測定黃酮類化合物的方法。
本發明提供了用槲皮素、山萘素、異鼠李素單體作為標準品測定黃酮醇及其苷的方法。
本發明提供的上述組合物可用於食品添加劑或加入飲料中。
本發明提供的上述組合物可用於霜劑、油膏劑或出現這些製劑的原料中。
本發明提供了含上述成份的口服劑。
上述口服劑型包括丸劑、膠囊、顆粒劑、片劑或懸浮液。
本發明提供了一種注射製劑，該注射劑可通過如下不同途徑使用，如靜脈、肌肉、皮下、腹腔注射。
本發明提供了採用上述成份的化妝品。
本發明提供了通過以上方法製備的藥用組合物，它含有上述有效量的上述組合物及藥用載體。本發明還提供了該藥用組合物的製備方法。
該發明可接受的藥用載體是指任何標準藥用載體。這些載體的實例是眾所周知的，包括但不限於標準藥用載體，例如磷酸鹽的緩衝生理鹽水液，含有聚山梨醇酯80、水的油/水混懸液和各種類型的溼潤劑的磷酸鹽緩衝生理鹽水，其他載體還包括滅菌溶液、片劑、包衣片和膠囊。
典型的載體包括賦形劑，例如澱粉、牛奶、糖、特種粘土、明膠、硬脂酸或鹽(包括硬脂酸鎂、鈣)、滑石粉、植物脂肪或植物油、樹膠、乙二醇或其它已知的賦形劑。載體也包括調味品和色素或其他添加劑。含有載體的組和物按常規方法配製。
本發明提供了一種治療冠心病引起的各種類型和程度的心絞痛的方法，該方法是將以上藥用組合物的有效劑量施予患者。
本發明提供了通過向患者施用以上藥用組合物的有效劑量改善局部缺血引起心動過速的方法。
本發明提供了通過向患者施用上述藥物組份的有效劑量緩解心絞痛的方法。
本發明提供了通過向患者施用上述藥物組份的有效劑量減少三硝酸甘油酯的用量的方法。
本發明提供了通過向患者施用上述藥物組份的有效劑量緩解心悸的方法。
本發明提供了通過向患者施用上述藥物組份的有效劑量使血脂不正常的病人降低血液中的膽固醇和甘油三酸酯的方法。
本發明提供了通過向患者施用上述藥物組份的有效劑量減少血液中血小板凝聚的方法。
本發明提供了通過向患者施用上述藥物組份的有效劑量提高運動耐受性，延長運動持續時間、延長運動開始到心絞痛發生以及開始運動到ST部分降低1mm之間的間隔時間的方法。
本發明提供了通過向患者施用以上有效劑量的藥用組合物治療陽萎的方法。
本發明提供了通過向患者施用以上有效劑量的藥用組合物治療牛皮癬的方法。
本發明提供了通過向患者施用以上有效劑量的藥用組合物治療色素沉著的方法。
本發明提供了通過向患者施用以上有效劑量的藥用組合物治療健忘、AIDS、早老性痴呆症(阿耳茨海默氏病)、心絞痛、動脈硬化、關節炎、哮喘、動脈粥樣硬化、孤獨症、遺尿、腦外傷、心律失調、凍瘡、風寒、冠心病、耳聾、痴呆、抑鬱、伴隨壞疽和絞痛的糖尿病血管收縮、頭昏、視力模糊、記憶力下降、疲勞、絲蟲病、頭痛、高血脂、高血壓、間歇性跛行、腎功能紊亂、腿部痙攣、心肌梗塞、帕金森症、血循環障礙、栓塞綜合症、雷諾氏症、風溼、衰老、胸悶、耳鳴、結核、靜脈曲張、眩暈的方法。
上述藥用組合物被用於治療疾病，因為它們具有如下作用鎮痛、止痛、緩解氣喘、消炎、阻止動脈粥樣硬化形成、抗菌、抗癌、抗凝血、抗糖尿病、降高血脂、降高血壓、抗核輻射、抗血小板凝聚、抗氧化、抗血栓、抗結核、抗咳嗽、支氣管擴張、毛細管擴張、毛細管保護、腦循環興奮劑、腦血管舒張藥、使注意力集中、改善記憶力、改善聽力、改善外周循環、增加多巴胺、腎上腺素、去甲腎上腺素、神經傳導、調節劑、防止頸動脈粥樣硬化和血管舒展劑等。
具體實施例方式
下述實例將更有助於對該發明的理解，有這方面知識的人將真正認識到，上面所說的這些方法和結果只不過是很表面的描述了該發明。以下的說明將較為詳盡。
下面的實例將有助於對本發明的理解，進而，本領域的技術人員將會認識上述方法和結果。
實例1、本發明提供了一種製備銀杏組合物的方法，步驟如下(a)提取銀杏綠葉在夏末到初秋時採集，此時，有效治療成分含量高而水份低於8％，乾燥後，在粉碎機裡粉碎成小於4mm的碎片，然後用12倍體積的60％的含水乙醇常壓下回流兩次，每次3小時，過濾除去固體殘渣後再用10倍體積的水進行第三次回流0.5小時，合併三次濾液。
(b)濃縮將步驟a得來的濾液減壓濃縮至不含醇的粘稠浸膏(密度d＝1.2～1.25，溫度t＝60℃)。
(c)沉澱用2倍量的熱水溶解步驟(b)的粘稠浸膏，冷卻後形成沉澱，過濾除去沉澱。
(d)柱層析將步驟(c)的濾液上大孔樹脂柱(XAD-4)使樹脂和葉子的比率為1∶1，用2倍量的純水、6％、18％、30％含水乙醇分別洗脫，最後用65％乙醇洗脫，直至流分顏色變淺。18％和30％流分合併後真空濃縮至不含醇的小體積，然後此濃縮液上聚醯胺柱，聚醯胺與粗葉比率為1∶3，用純水和95％乙醇分別洗脫，將95％的流分和大孔樹脂柱65％的流分合併，真空濃縮至不含醇。
(e)去除銀杏酸用三分之二體積的環己烷萃取步驟(d)的濃縮液三次，含水部分減壓濃縮。
(f)乾燥將濃縮的浸膏的密度調整至1.05，然後噴霧乾燥，噴霧乾燥室溫度控制在140～160℃。
成品為棕黃色粉末，有特殊香味，略有苦味。
前述方法具體來說，柱層析的特點是二次處理，即浸膏首先上大孔樹脂柱(XAD-4)，柱與葉子的比率為1∶1，接著上聚醯胺柱，柱與葉子的比率為1∶3。
具體來說，除去銀杏酸的特點就是通過二次處理，即浸膏經過大孔樹脂柱(XAD-4)層析，然後用環己烷處理三次。
實例2、本發明提供了一個製備銀杏組合物的方法，步驟如下(a)提取採集夏末秋初的銀杏綠葉，此時的有效治療成分含量高而水份含量低於8％，乾燥後，在粉碎機裡粉碎成小於4mm的葉片。然後用12倍量的溶劑系統回流2次，每次1～3小時，，溶劑系統可採用水，水-乙醇和丙酮-水，過濾除去固體或渣，合併上述的兩次濾液。
(b)濃縮步驟(a)得到的濾液經真空濃縮成不含有機溶劑的浸膏，(d＝1.2～1.25，t＝60℃)(c)沉澱將步驟(b)得到的浸膏溶解於2倍量的沸水中，冷卻至約12℃，有沉澱形成，過濾分離。
(d)柱層析將步驟(c)得到的浸膏上某一樹脂柱，用水或水和有機溶劑的混合溶劑洗脫，混合溶劑可選用1～3個碳的醇和丙酮。洗脫流分濃縮後上另一種樹脂柱，用一或兩種溶劑系統洗脫，溶劑系統可選擇水、1～3個碳的醇，酮和酯，然後可得到含高含量的內酯和黃酮類化合物的流分，減壓濃縮此流分除去含水醇。
(e)除去銀杏酸將步驟(d)得到的濃縮液用三分之二體積飽和或不飽和烷烴萃取三次，水部分真空濃縮。
(f)乾燥將濃縮浸膏的密度調整至1.02～1.10(40℃)，然後噴霧乾燥，噴霧乾燥室溫控制在140～160℃。
實例3、本發明提供了一製備銀杏組合物的方法，步驟如下將100kg乾燥銀杏葉粉末和1000kg，50％乙醇溶液回流2小時，過濾、將過濾殘渣再用1000kg，50％含水乙醇回流2小時，過濾，合併兩次濾液，在60℃下真空濃縮至無醇(d＝1.2)，將濃縮液溶解於300kg水中並放置48小時，過濾。將濾液上大孔樹脂和聚醯胺的混和柱，分別用100kg的水，100kg30％乙醇溶液，100kg60％乙醇溶液、100kg 90％乙醇溶液洗脫，合併30％、60％、90％乙醇的水溶液洗脫液，真空濃縮合併液至約70kg的浸膏，用正己烷萃取浸膏三次，將水相真空濃縮和乾燥。1.5kg的最終產品含水低於5％，含47.2％黃酮類化合物，其中黃酮苷約24.8％，內酯6.3％和低於5ppm的銀杏酸。
實例4、從實例3的柱層析開始從柱上下來的用30％的乙醇水溶液洗脫的流分經減壓濃縮，除去乙醇，濃縮液萃取三次，每次用三分之二體積的乙酸乙酯萃取。將乙酸乙酯相在45℃減壓蒸發，殘留物用50％乙醇水溶液加熱溶解，放置24小時，形成銀杏內酯結出。分離結晶後，母液減壓蒸發，分別用1.5倍重量活性炭和矽膠進行層柱分離，將所有白果內酯和銀杏內酯的部分分別收集；濃縮至幹，與銀杏內酯結晶(A)10g合併，總萜內酯的含量不低於80％。
收集合併實例3中從柱中洗脫的60％乙醇水溶液部分和70％乙醇水溶液部分。減壓濃縮至完全無醇。此濃縮物上聚醯胺柱，分別用10％、20％、75％和90％乙醇水溶液洗脫。將75％流分濃縮至幹，粉狀物用無水乙醇溶解，上聚醯胺柱，分別用100％乙醇、70％乙醇水溶液和20％乙醇水溶液洗脫，收集70％乙醇水溶液，與2kg矽膠混合，將混和物濃縮至幹，用乙酸乙酯、乙醇分別洗脫。濃縮乙醇部分至幹得(B)90g。總黃酮含量不低於80％。
高含量的內酯(A)和黃酮(B)浸膏按不同比例混合，得到不同含量的最終產品，例如10g(A)和90g(B)，得100g(A+B)，此混合物中含77％黃酮類化合物和8％內酯，10g(A)和70g(B)混和得80g(A+B)，則這一產品含70％黃酮和10％內酯。
實例5、鑑別和定量分析黃酮，內酯和銀杏酸的方法，以及確定黃酮、內酯、萜烯內酯含量的方法。
本發明提供了一種鑑別和定量分析銀杏葉組合物中黃酮的方法，步驟如下(a)製備供試液將0.1g組合物溶解於1ml甲醇。
(b)製備標準液將1g標準銀杏葉用10ml 60％乙醇回流2小時，過濾、濃縮濾液、蒸乾乙醇；分別用10ml的石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取、濃縮正丁醇部分至幹並將它溶解於1ml甲醇中。
(c)測定供試液在相同的矽膠薄板上將上述每個溶液點樣10μl，用乙酸乙酯∶甲酸∶乙酸∶水(100∶11∶11∶26)的混和溶劑展開後，將溶劑在空氣中吹乾除盡，用1％氯化鋁乙醇溶液噴塗，365nm紫外燈下觀察，在標準樣品和供試樣品色譜圖上，在指定的位置可看到8個黃色斑點。
本發明提供了一種鑑別和定量分析銀杏組合物中內酯的方法，步驟如下
(a)製備供試液用20ml乙酸乙酯回流0.5g組合物30min，過濾、濃縮濾液至幹溶解於2ml甲醇中。
(b)製備標準液，各取銀杏內酯A、B、C、J和白果內酯B的標準品，溶解於甲醇中，得到5種0.5mg/1ml的標準品溶液。
(c)測試供試液將上述溶液各吸取10μl，點在同樣的矽膠GF254板上，用乙酸乙酯∶甲苯∶丙酮∶環己烷(4∶3∶2∶1)的混和溶劑展開後，在空氣中吹乾溶劑，150℃加熱1小時，在254nm波長光下觀察，供試品和標準樣品在指定的位置可看到相同顏色的色譜斑點。
本發明提供了一種鑑別和定量分析銀杏混和物中銀杏酸的方法，步驟如下(a)製備供試液將4g組合物加100ml正己烷回流2小時，過濾，濃縮濾液至幹，並溶解在1ml乙酸乙酯中。
(b)製備標準液將銀杏酸標準品溶於乙酸乙酯，使該溶液為每毫升含0.04mg標準品，(c)測試供試液將上述溶液各吸取10μl分別點在同樣的矽膠GF254薄板上，用正己烷∶乙酸乙酯∶乙酸(80∶15∶5)的混和溶劑展開後，在空氣中吹乾溶劑，在315nm波長處和368nm波長處的紫外燈下觀察，供試液的吸收應低於標準液的吸收(0.0005％)。
本發明提供了一定量分析銀杏葉組合物中黃酮化合物總含量的方法，步驟如下(a)製備標準品溶液將20mg乾燥蘆丁溶於70ml 70％含水乙醇中。
(b)繪製標準曲線各吸取該標準液0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2ml，到10ml的容量瓶中，分別加入3ml水，2ml的乙酸-乙酸鈉的緩衝液(PH＝4.5)，2ml的0.1M的氯化鋁，然後用70％含水乙醇加至10ml，在270nm處根據每個標準液樣品的吸收繪製標準曲線。
(c)用分光光度法測定供試液在50ml的容量瓶中將25mg銀杏組合物溶於70％含水乙醇中。吸取0.5ml該溶液加到一10ml容量瓶中，參照上述方法製備成供試液，在270nm處測定其吸收，由標準曲線可得知供試液濃度，在無水情況下，總黃酮量以蘆丁計為標示量的85～115％之間。
本發明提供了一測定黃酮苷含量的方法，步驟如下(a)製備供試液用20ml甲醇和5ml 25％的鹽酸溶解75mg銀杏葉組合物，並回流60min，分離後，放置冷卻並立即轉移至50ml的容量瓶中，燒瓶用5ml甲醇洗3次，洗滌液併入容量瓶，用甲醇稀釋至刻度。
(b)製備標準液將4.2mg的槲皮素、6.0mg的山萘素、1.2mg的異鼠李素用甲醇溶解於一個50ml的容量瓶中，並用甲醇稀釋。此標準液每1ml中含24μg的異鼠李素，84μg的槲皮素、120μg的山萘素。
(c)測定供試液計算HPLC的相對峰面積來測定山萘素、槲皮素和異鼠李素的含量。總的黃酮苷含量＝槲皮素含量×2.50+山萘素的量×2.63+異鼠李素的量×2.36。
本發明提供了一測定萜烯內酯含量的方法，步驟如下(a)製備供試液將100mg組合物和60ml丙酮一起回流2小時，過濾後，濃縮濾液，殘渣再用20ml乙酸甲酯溶解，用10ml水萃取，水層再用20ml乙酸甲酯萃取，合併兩次的乙酸甲酯液層，濃縮至幹並溶解於5ml甲醇中。
(b)製備標準液用甲醇溶解各30mg銀杏內酯A、B、C、J和白果內酯(BB)於50ml的容量瓶中。
(c)測定供試液標準品和供試品進樣量各15μl得，到它們的液相色譜圖，用外標法可計算出銀杏內酯A(GA)、B、C、J和白果內酯(BB)各自的含量，再計算出總的內酯含量，在無水浸膏中總的萜烯內酯含量約5～20％。
上述方法具體來說，用高度純化的化學結構為C27H30O16的蘆丁單體作為標準品，測定銀杏總黃酮類化合物含量。
上述方法具體說來，用高度純化的化學結構明確的槲皮素、山萘素、異鼠李素的單體作標準品，來測定銀杏葉組合物中黃酮醇苷和黃酮苷的含量。
上述方法具體說來即用高度純化、化學結構明確的GA、GB、GC、GJ和BB作標準品，鑑別內酯並測定內酯含量。
上述方法具體來說即用高度純化、化學結構明確的銀杏酸作標準品，來鑑定銀杏葉組合物中的銀杏酸。
實例6、包衣片，每片含銀杏浸膏 40.00mg乳糖 100.00mg澱粉 40.00mg微晶纖維素 36.00mg羥丙基甲基纖維素 30.00mg硬脂酸鎂 1.50mg歐巴託(OPADRY)(用於包衣) 7.50mg包衣片總量 約255.00mg實例7、顆粒劑每袋的組成銀杏浸膏 40mg蔗糖 420mg糊精 480mg澱粉 20mg羥丙基纖維素 20mg甜葡糖苷 20mg顆粒總量 1000mg實例8、注射液1安瓿包括銀杏浸膏 40mg甘露醇 100mg煙醯胺 100mg精氨酸單鹽酸鹽 50mg乙二胺四乙酸二鈉(EDTA-2Na) 4.00mg實例9、飲料500ml飲料包括銀杏浸膏 2.0g38％乙醇 500ml香料 適量實驗數據本發明中描述的銀杏提取物可用常規方法配製製劑，例如，可製成口服液，包衣片劑，片劑或注射劑。本發明中的製劑可用來治療腦血管和外周血管循環障礙，尤其是可用於治療冠脈疾病所引起的心絞痛，在中國進行的臨床試驗表明，共243個病例證實了銀杏提取物在治療冠心疾病引起的心絞痛是安全有效的，臨床試驗詳細情況概述如下參加醫院4家醫院參加了這項臨床試驗，包括北京中醫藥大學附屬東直門醫院；上海醫科大學附屬華山醫院；上海第二醫科大學附屬第九人民醫院；上海中醫藥大學附屬龍華醫院。
病人選擇標準臨床試驗在1995年11月至1996年7月進行，243個患有冠脈疾病引起的心絞痛病人參與了試驗。
選擇病人的標準如下
入選標準病人被明確診斷為心絞痛，胸痛每周發作2次以上。心電圖上缺血改變或運動測試結果為陽性。
排除標準(1)病人具活動性心肌缺損或別的心肺功能疾病者，以及重度神經官能症，更年期綜合症和頸椎病引起的胸痛。(2)病人患心絞痛並有高血壓者(BP＞24/14.87Kpa)。(3)病人具嚴重的心肺功能衰竭，嚴重的心律失常，肝腎功能異常和造血功能障礙者。(4)哺乳期婦女和過敏體質患者。(5)年齡小於18歲或是大於70歲者。
刪除數據標準不按處方服藥的病人和缺少資料，臨床試驗結果無法確定的病人。
研究者隨機把153個病人分屬銀杏組，90個病人分屬對照組。銀杏組再隨機分組，123個屬測試組，30個屬開放組。在4個醫院中治療的243位病人的基礎數據是表1-表5，結果表明，三組中的性別、年齡、發病時間，心絞痛和併發症的種類和嚴重程度均表現出顯著差異，住院比例為72.4％。
表1 3組中年齡平均值和性別分布情況P＞0.05

表2 3組中疾病持續時間P＞0.05

表3 3組中心絞痛嚴重程度P＞0.05

表4 3組中心絞痛類型P＞0.05

表5 3組中心絞痛的併發症P＞0.05

診斷標準1、心絞痛嚴重程度的診斷標準在臨床試驗中心絞痛嚴重程度的診斷標準是參照1979年中西藥結合治療冠心病心絞痛及心律失常研討會《冠心病心絞痛及心電圖療效評定標準》，標準詳述如下(1)輕度典型的心絞痛發作常持續幾分鐘，1天發作1-3次或每周2～3次，發作並不嚴重，但病人有時需要服用硝酸甘油。
(2)中等程度每天心絞痛發作超過3次，每次持續幾分鐘至10分鐘，疼痛比輕度發作嚴重，且病人通常需要服用硝酸甘油。
(3)嚴重每天心絞痛發作頻繁，持續時間長且嚴重，日常生活受影響，病人經常服用硝酸甘油。
2、心絞痛類型的診斷標準在臨床試驗中心絞痛類型的診斷標準為國際心臟病學會及世界衛生組織聯合委員會制訂的《缺血性心臟病臨床診斷標準》，診斷標準詳述如下(1)勞累型心絞痛由於過度疲勞或其它增加心肌耗氧量需求引起的短暫性胸痛發作，疼痛通過休息或服用硝酸甘油後能迅速緩解。
(2)自發性心絞痛胸痛發作與任何提高心肌耗氧量的狀況無明顯關係，與勞累型心絞痛相比，疼痛持續時間長且更嚴重，通常服用硝酸甘油不易緩解。
(3)混合型心絞痛自發性心絞痛可伴隨勞累型心絞痛產生，稱為混合型心絞痛。
臨床試驗方案設計臨床試驗按以下方法進行243個患冠脈疾病引起的心絞痛患者參加了試驗。研究者把153個病人作為銀杏試驗組，90個病人為對照組，銀杏試驗組再隨機把123個病人分為測試組，30個病人分為開放組，這213個測試組與對照組的病例採用雙盲，放大平行對照和開放治療法進行。銀杏組所用藥物為這項發明所述銀杏提取物的製劑。1g製劑含40mg銀杏提取物，480mg糊精，420mg蔗糖，20mg澱粉，20mg低取代羥丙基纖維素和20mg甜菊糖甙。銀杏製劑先製成顆粒然後裝入小袋，每袋1g在臨床試驗中病人每次服用1袋銀杏製劑，每天3次，治療周期為6周。
對照組所用藥物為百路達(Brainway)，由位於中國上海四川北路70號的上海信誼藥廠生產。臨床試驗中病人每次服1粒百路達，每天3次。作為陽性對照品，治療周期同樣6周。
由於兩藥劑型不同(顆粒劑和膠囊)，所以各組均加服不同劑型的空白安慰劑，即治療組除服用銀杏顆粒外，加服空白膠囊(安慰劑)，對照組服用百路達外，加服空白顆粒劑(安慰劑)。各安慰劑的包裝、外觀均與相應藥物完全一致。
從臨床試驗前一周開始，停服長效冠心病藥物。病人患輕度高血壓者允許服用他們的常用藥。如病人不能忍受心絞痛發作時，硝酸甘油可暫時服用。
評估藥物療效的標準是根據中國衛生部1993年頒布的《中藥新藥臨床試驗指南》關於冠心病心絞痛病人的治療這一部分以及1979年中西藥結合治療冠心病心絞痛及心律失常研討會，《冠心病心絞痛及心電圖療效評定標準》進行評價。標準詳述如下對輕度心絞痛病人(1)顯效胸痛消失或基本消失(2)有效胸痛發作明顯減輕(3)無效胸痛症狀無改善(4)惡化胸痛發作加重，達到「中度」以上標準度。
對中度心絞痛病人(1)顯效胸痛症狀消失(2)有效胸痛減輕或達到輕度標準(3)無效沒有觀察到有改善(4)惡化胸痛加劇，達到「較重度」水平。
對較重心絞痛病人(1)顯效胸痛消失或減輕到「輕度」標準(2)有效胸痛減輕到「中度」標準(3)無效胸痛症狀與治療前相同(4)加重胸痛症狀加重(或達到「重症標準」)。
心電圖療效評價標準(1)顯效心電圖恢復到「大致正常」或達到「正常心電圖」(2)有效降低的S-T段，提高＞0.05mv，但不到正常水平，T波變化降低，或T波變化從平到向上，房室阻滯或室內傳導阻滯改善。
(3)無效在心電圖上未觀察到改善。
(4)加重治療後S-T段降低加重，T波加深或T波從平坦變為倒置，以及出現異位心律及心律失常者。
計算停止硝酸甘油停減率 臨床試驗結論在臨床試驗中，銀杏組和對照組沒有觀察到明顯的副作用，只有3個病人在治療過程中有胃不適，其中一位病人有輕度嘔吐，未經治療即緩解。
從隨機對照、雙盲和開放的臨床試驗資料結果表明，這項發明中銀杏提取物製劑在治療冠心病心絞痛是安全、有效的。銀杏製劑顯示了很強的生物活性，與現有的治療心絞痛的中藥製劑比較，在安全性和有效性兩方面，銀杏製劑在一個或多個方面已超過現有製劑，且能降低硝酸甘油的使用。
1、銀杏製劑藥效成份在治療冠心病心絞痛時是有效的，且療效超過了對照藥物。
表6銀杏提取物藥效成份對心絞痛病人的作用

**P＜0.01，*P＜0.05，與對照組比。
2、銀杏製劑藥效成份在改善缺血性心電圖時是有效的，且有效率超過了對照組。
表7銀杏提取物藥效成份改善缺血性心電圖的作用

3、銀杏製劑藥效成份在減輕心絞痛過程中是有效的，且在減少硝酸甘油的使用上作用強於對照組。
表8銀杏提取物藥效成份對硝酸甘油停減情況

*P＜0.01，與對照組比4、銀杏製劑藥效成份能有效減輕心悸，且有效率超過了對照組。
表9銀杏提取物藥效成份對心絞痛症狀的改善

*P＜0.01與對照組比5、銀杏製劑有效成份能有效降低血脂異常病人的膽固醇及甘油三酯水平。
表10銀杏提取物有效成份對血脂異常病人血脂的作用

*P＜0.05，與給藥前比6、銀杏製劑藥效成份能降低中等密度和低密度全血比重，抑制血小板聚集，且給藥前與給藥後差異顯著。
表11銀杏提取物藥效成份對病人血象變化的作用

*P＜0.05，**P＜0.01與給藥前比。
7、銀杏製劑藥效成份具有改善運動耐受力和延長運動持續時間，延長運動開始和心絞痛發作間隔時間，以及運動開始至ST段降低1mm間隔時間。且此作用強於對照藥物。
表12 銀杏提取物藥效成份對病人運動能力的作用

*P＜0.05**P＜0.01與給藥前比^P＜0.05^^P＜0.01與對照組比8、銀杏製劑藥效成份可用於各種類型與不同程度的心絞痛，(表13、14)，且不影響血壓和心率(表15)，也不影響肝、腎功能。
表13銀杏提取物藥效成份對3種程度心絞痛的作用

表14銀杏提取物藥效成份對3種類型心絞痛的作用

表15 3組病人給藥前後血壓和心率變化表(X±SD)

表16銀杏提取物藥效成份對病人肝腎功能的影響

通過上述說明可見，本發明提供了一種新的銀杏葉提取物組合物，該組合物的製備方法，以及組合物中各種成分的檢測方法。所述組合物可用作食品添加劑或加到飲料中，也可添加到霜劑、油膏劑或製作它們的原料中。所述組合物也可製成口服製劑、注射劑或化妝品。將本發明的組合物與藥用載體結合可製成藥用組合物從而治療冠心病引起的不同程度不同類型的心絞痛、缺血性心臟病、心悸、降低血小板凝集、改善運動耐受力和延長運動持久力、治療陽萎、牛皮癬、色素沉著等疾病。
權利要求
1.一種測定銀杏葉組合物中萜內酯含量的方法，包括以下步驟a)將組合物以丙酮回流，過濾後，濾液濃縮，將殘渣溶於乙酸甲酯，用水萃取；水層再以乙酸甲酯萃取；合併兩乙酸甲酸層濃縮至幹，溶於甲醇以備檢驗；b)將銀杏內酯A、銀杏內酯B、銀杏內酯C和銀杏內酯J和白果內酯用甲醇溶於相同的容量瓶作為標準溶液；c)依據HPLC方法檢測，將標準品和供試品分別進樣並記錄譜圖，銀杏內酯A、銀杏內酯B、銀杏內酯C、銀杏內酯J和白果內酯的量可通過每個圖譜外標法計算得到，總萜內酯的含量為它們之和。
2.根據權利要求1的方法，其特徵在於其中以所述的銀杏內酯A、銀杏內酯B、銀杏內酯C、銀杏內酯J和白果內酯單體作為標準品以測定銀杏組合物中萜內酯的含量。
全文摘要
本發明涉及測定銀杏葉組合物中萜內酯含量的方法。本發明方法是用HPLC方法檢驗，用銀杏內酯A、銀杏內酯B、銀杏內酯C、銀杏內酯J和白果內酯的甲醇溶液作為標準溶液，用測得的供試樣品中這幾種內酯含量的總和作為樣品總萜內酯含量。
文檔編號G01N1/28GK1740786SQ20051010521
公開日2006年3月1日 申請日期1999年3月19日 優先權日1998年3月19日
發明者謝德隆, 王寧, 高崎, 張國安, 邵寶平, 金小吾, 黃新生 申請人:上海杏靈科技藥業股份有限公司