藍色刺孢黴菌株的發酵方法
2023-05-13 11:50:21 1
專利名稱：藍色刺孢黴菌株的發酵方法
藍色刺孢黴菌株的發酵方法
技術領域：
本發明涉及誘變選育的藍色刺孢黴發酵方法，屬於生物工程和酶製劑製備技術領域。
背景技術：
凝乳酶是奶酪生產中最關鍵性酶，自從被發現以來一直被廣泛應用於奶酪製造工業。奶酪因其豐富的營養價值和美味的口感而受到世界人們的廣泛喜愛，全球每年大約需要宰殺5000萬頭小牛來滿足凝乳酶的市場需求。近年來隨著人們生活水平的提高，奶酪的需求量不斷增大，小牛皺胃酶供應短缺。因此，科學家們千方百計地尋找小牛皺胃酶的代用品O藍色刺孢黴是我們從紅曲米中分離純化出的一株產凝乳酶的菌株。但是這株菌產的凝乳酶活力不高，我們以藍色刺孢黴為出發菌株，應用紫外線和硫酸二乙酯複合因子誘變出發菌株。誘變選育的優良菌種DUlO (微生物保藏號是=CGMCC 5423)，以葡萄糖馬鈴薯培養基為發酵培養基，發酵液凝乳酶酶活在110SU/mL左右波動,但所產酶活仍不夠理想。因而要對培養基進行了優化，通過優化選出了最優培養基，仍需對DUlO的發酵工藝參數進一步加深，來提高發酵液凝乳酶活性。發酵工藝參數的改進則需聯繫到培養溫度、搖床轉速、培養時間和三角瓶裝液量等。
發明內容本發明的 目的是提供一種誘變選育後藍色刺孢黴優良菌株發酵條件優化的方法，提高藍色刺孢黴凝乳酶活力。主要工藝路線利用誘變後的藍色刺孢黴優良菌株DUlO(微生物保減號是=CGMCC 5423)，通過改變發酵條件控制其代謝，生產出凝乳酶活力較高的發酵液。本技術方案如下I)無菌操作注入IOmL無菌水到保存的DUlO PDA斜面中，洗下斜面上的孢子，然後振蕩使孢子分散，G3玻璃漏鬥過濾，血球板計數並調整孢子濃度為IO7 IO8個/mL。2)接種由斜面製備的IO7 IO8個/mL孢子懸浮液，分別變換培養時間、裝液量、接種量、培養溫度、轉速、發酵時間，進行單因素實驗，考察每個培養條件對發酵產酶品質的影響。測定發酵液的凝乳酶酶活(MCA)和蛋白水解活性(PA)，發酵液凝乳酶活越高，MCA/PA比值越大，則發酵所產凝乳酶越好。3)最優發酵產酶條件的驗證發酵罐驗證根據實驗選擇的最優發酵條件，配製4L發酵培養基裝入IOL發酵罐，最優發酵條件培養後測發酵液凝乳酶酶活。上述步驟2)中發酵培養基的優選配方如下，均為百分含量葡萄糖3. 3 3. 8 %，蛋白腖 O. 38 O. 42 %，酵母膏 O. 58 O. 62 %，CaCl2O. 05%, MnSO4 O. 25%，吐溫-800. 1%，蒸餾水補足 IOOOmL, pH 自然，121°C滅菌 20min。
上述試劑和培養基配方，如無特別說明，均為本領域常規試劑和培養基。上述步驟2)中凝乳酶活力的測定方法為用O. 01mol/L的CaCl2配製100g/L的脫脂乳，放置40min使所形成的牛乳體系趨於穩定，然後取5mL脫脂乳於試管中36°C保溫5min。發酵液5000r/min離心IOmin使菌絲沉澱,取其上清液O. 5mL加入保溫的脫脂乳中，漩渦混合器上迅速混合均勻並開始計時，當試管壁上有凝結小塊，準確記錄發酵上清液使牛乳凝固的時間。定義40min凝固100g/L的脫脂乳ImL所需的凝乳酶量為一個索氏單位(Soxhelt unit, SU)。凝乳酶活公式為
權利要求
1.誘變選育後藍色刺孢黴優良菌株發酵的方法，步驟如下 1)無菌操作注入無菌水到保存的DU10PDA斜面中，洗下斜面上的孢子，然後振蕩使孢子分散，玻璃漏鬥過濾，血球板計數並調整孢子濃度為IO7 IO8個/mL，其中所述的DUlO為藍色刺孢黴優良菌株，其微生物保藏號是CGMCC 5423 ； 2)在含有培養基的三角瓶中接種由斜面製備的IO7 IO8個/mL孢子懸浮液，裝液量為55 60mL，接種量為1. O 1. 3%，培養溫度為27 30°C，轉速為170 180r/min，培養時間為108 120h ； 所述的培養基由以下原料製成葡萄糖3. 3 3. 8%，蛋白腖O. 38 O. 42%，酵母膏O.58 O. 62 %，CaCl2 O. 03-0. 07 %，MnSO4 O. 15-0. 35 %，吐溫-80 O. 05-0. 2 %，蒸餾水補足IOOOmL, pH自然，滅菌。
2.根據權利要求1所述的誘變選育後藍色刺孢黴優良菌株發酵的方法，其特徵在於包括發酵液的凝乳酶酶活和蛋白水解活性的測定步驟。
3.權利要求1所述的方法得到的發酵液在製備乾酪中的應用。
全文摘要
本發明涉及誘變選育後藍色刺孢黴優良菌株的發酵方法，屬於生物工程和酶製劑製備技術領域，通過單因素實驗改變發酵工藝參數中的培養溫度、搖床轉速、培養時間、接種量和裝液量等因素，最終確定最優發酵條件。驗證實驗得到發酵液凝乳酶酶活可達610.52SU/mL，比初始酶活310.36SU/mL提高了96.71％。
文檔編號C12Q1/37GK103045571SQ201110397690
公開日2013年4月17日 申請日期2011年12月5日 優先權日2011年12月5日
發明者王成忠, 趙曉紅, 孫秋燕 申請人:山東輕工業學院