一種半纖維素酶及其在製備殼寡糖中的應用的製作方法

2023-05-18 17:11:01 1

專利名稱：一種半纖維素酶及其在製備殼寡糖中的應用的製作方法
技術領域：
本發明是關於一種半纖維素酶及其在製備殼寡糖中的應用。
背景技術：
甲殼素是以江、河、湖、海中大量存在的蝦、蟹殼為原料進行生產加工的天然動物性膳食纖維。殼聚糖是在濃鹼的作用下脫去甲殼素分子中的乙醯基而得到的一種天然高分子化合物，在自然界中的含量僅次於纖維素。甲殼素以具加工方法的不同主要分為以下三個層次的系列衍生產品A.幾丁質(甲殼質)，分子量達到100萬以上，其吸收能力強，適合工業和環保應用，但不溶於酸鹼，也不溶於水，很難被人體吸收。B.幾丁聚糖(殼聚糖)，分子量在10萬左右，一般只溶於有機弱酸，不溶於水，可以被人體吸收，可以作為食品添加劑及保健品原料等，有著極其廣泛的推廣價值。C.殼寡糖，分子量低於5000，具水溶性，可直接被人體吸收，速度快，效果顯著。已經證明，由殼聚糖降解生成的殼寡糖，更具有獨特的生理活性和理化性質，是甲殼素系列產品中應用性能最好的產品。
目前，國內外降解製備殼寡糖的方法大致可分為酶降解法、氧化降解法和酸降解法三大類。利用生物酶法降解製備殼寡糖的過程明顯優於另兩種化學降解法，這是由於酶法降解過程使降解產物的分子量分布更容易被控制，能對降解過程進行監控，生產出有效組份(殼3-10糖)含量較高的殼寡糖，且降解條件比較溫和，無需加入大量的反應試劑，對環境汙染較少。1999年第二期《中國海洋藥物》登載「高產殼聚糖酶菌種的篩選及其降解殼聚糖反應初探」一文論述了中科院大連化學物理生化室通過兩輪有效的紫外線誘變，獲得了2株具有高產殼聚糖酶的突變株，具有較好的穩定性，其發酵液的粗酶活性達0.2u/ml，儘管其比原始保存突變菌株酶活性提高了8倍，並得到一定量殼寡糖，但其酶活性仍然較低，不能實現工業化生產。殼聚糖降解酶數量眾多，降解的殼聚糖酶普遍存在酶活性低、副反應多和酶解時間長、能耗高等問題。

發明內容
本發明的目的在於提供一種由微生物發酵產生的半纖維素酶和利用該半纖維素酶製備殼寡糖的工藝方法，使該半纖維素酶具有較高的活性，提高酶解效率，並且使產物中的有效成份即殼3-10糖的含量大大提高，從而使應用半纖維素酶實現工業化生產低聚寡糖成為可能。
使用的微生物過快速平板鑑定並通過搖瓶，酶測篩選到了一株可迅速降解殼聚糖為殼寡糖的短小芽孢桿菌(Bacillus Pumilus)半纖酶A1號(以下簡稱半纖酶A1號菌株)，該菌株於2001年7月8日在中國典型培養物保藏中心保藏，保藏編號為CCTCCM201023，該菌株經優化培養，發酵達到300μ/ml以上的半纖維酶活性。1ml粗酶液可在5～10小時內有效降解10％濃度的殼聚糖為3～10糖為主的寡糖，並經質譜與分析鑑定證實，使工業化生產殼寡糖成為可能。
本發明使用的半纖酶A1號菌株的性質屬短小型桿菌，具芽孢，為革蘭氏陽性細菌；菌落形態，圓型，白色，半透明，有光澤，在多聚蛋白腖培養基上較易生長，最適培養溫度36℃。
本發明內容包括生產半纖維素酶的產酶工藝和生產殼寡糖的酶解工藝兩方面。
產酶工藝過程是半纖酶A1號菌株→上罐發酵→低溫離心→去雜質→低溫保存酶液。
應用正交實驗法(L4(23)即三因素二水平四次正交實驗)進行培養基配方優化，表明產酶穩定，平均酶活力達308u/ml。適宜產酶PH值為6.5，產酶高峰期為12～24小時。酶作用適宜PH值為5.5-6.5，最適宜PH值為6.0，酶作用適宜溫度為45℃-48℃，最適溫度為48℃，PH值為6.7時穩定性較好，酶的純化方法一般為鹽析，有機溶劑沉澱，離子交換，吸附層析，凝膠過濾，親和層析，膜分離，低溫高速離心等，在生產時採用連續流離心即可，其分離效果好、方便，酶收率在84％以上。
酶的產生條件(1)培養基成份對產酶的影響應用正交試驗法對中糊精、胰蛋白腖、酵母抽提物用3種主成份進行了優化，結果如表面1。對表1試驗結果分析計算，發現各因素對酶活力影響的主次為B＞C＞A，其優化配方為中糊精10％、胰蛋白腖1％、酵母抽提物0.5％。按優化酶方重現實驗表明產酶穩定，平均酶活力達308u/ml。
L4(23)表面化培養基配方優化方案表(L4(23)即三因素二水平四次正交試驗)

.發酵工藝對產生酶的影響A.PH值對產酶的影響由搖瓶試驗應用0.618對培養基起PH值進行優選。結果見表二。表明適宜產酶PH值為6.5。
表2培養基PH對產酶的影響

B.產酶時間過程於不同培養時間取樣，測試酶活性，結果見表3表3產酶時間過程

分析表明12-24h為產酶高峰期，在24h達到最高水平，延遲後酶活性下降，可能是營養消耗，菌體自溶。
C.溶氧短小芽孢桿菌是好氣性細菌，在發酵過程中需要消耗大量溶氧；提高攪拌轉速，加在通風量均能有效提高溶氧。經試驗，選定的攪拌轉速為350-500r/min(隨著發酵時間的延長逐漸提高轉速)，通風量在發酵過程中，通氣不間斷在0-16h，通氣量為0.8m3/min；在16-24h通氣量為0.6m3/min，全過程的溶氧值控制在65％～85％之間。
D.消泡劑產酶發酵過程中會產生大量泡沫，由於泡沫的表面張力會使酶的活力降低，因此要及時消泡，根據發酵情況通過蠕動泵向罐中自動加聚醚類消泡劑。
本發明半纖維素酶的一般性質A.酶作用最適PH值於不同PH值條件下進行酶反應。酶作用適宜PH值為5.5～6.5，最適PH值為6.0。
B.酶作用最適溫度於不同溫度條件下進行酶反應。酶作用適溫度為45～48℃，最適溫度為50℃。
C.PH值對酶穩定性的影響酶於不同PH值緩衝體系中保存15min，測酶活表明PH值6.7時穩定性較好。
D.PH值對酶穩定範圍性的影響酶於0.05mol/L，PH6.0的磷酸緩衝液中，在不同溫度保溫15min，結果表明該酶熱穩定性較差，60℃保溫15min，酶活僅剩餘22％，故應在低溫下保存。
酶的純化半纖維素酶常和其他酶共同存在於發酵體系中，且自身還有多種分子型，因而純化較困難。一般採用的方法有鹽析、有機溶劑沉澱、離子交換、吸附層析、凝膠過濾、親和層析、膜分離、低溫高速離心等，考慮到生產的要求，可採用連續流離心即可，其分離效果好，方便，酶收率在84％以上。
本發明生產殼寡糖的酶解工藝過程是殼聚糖冰乙酸溶液→入罐酶解→離心、絮凝、過濾、去雜質→脫色、脫味、分級→凍幹(噴幹)→殼寡糖酶解工藝根據殼聚糖原料的溶解性差異，對應殼聚糖的量不同，一般是0.2ml冰乙酸(95％)比1g殼聚糖即能使殼聚糖充分溶解又不過量。冰乙酸溶液的濃度按底物濃度的變化來調節，比如如果要求達到10％的底物濃度，每g殼聚糖對應0.2ml95％的冰乙酸，配100ml溶液需要殼聚糖10g，冰乙酸2ml，蒸餾水100ml。殼聚糖原料的性狀不同，則加酶量也不同。為了得到特定分子量分布的產品，可通過底物濃度、加酶量、酶解時間的改變來調控。
本發明與現有技術相比具有以下突出特點1.高效產酶菌株目前，一般菌株發酵產殼聚糖酶的周期在6-7天(參閱《中國海洋藥物》1999年第二期「高產殼聚糖酶菌株的篩選及降解殼聚糖反應初探」一文)，本發明採用的菌株則是通過誘變、篩選出的高效菌株，發酵周期僅需18-24小時，產酶效率大大提高。
2.酶的活性大大提高現有殼聚糖酶的酶活性僅為0.2u/ml，而本發明提供的酶則是高活性半纖維素酶，酶活性達300u/ml。(酶活力的測定用1％冰乙酸(95％)溶液配置濃度為1％的殼聚糖溶液，溶充分後於48℃，PH值為5.4條件下，酶解底物每分鐘釋放1umol的還原糖所需的酶量為一個活力單位U。)3.酶解工藝效率高水解效率高 在一般殼聚糖酶法工藝中，水解底物需2-3天時間。而本發明水解工藝中，水解時間僅需8-10小時。
4.產物中有效組份含量高化學法製備殼寡糖，其產物中有效組份(殼3-10糖)僅佔20％左右。而本發明的水解產物，通過質譜分析，其有效組份(殼3-10糖)在70％以上，遠高於國內外報導的化學法收率，如一九九九年《第二屆甲殼素化學與應用研討會論文集》登載的題為「水溶性殼聚糖的製備」一文中報導化學法有效收率不到20％。
本項目主要技術性能指標與國內外同類產品指標比較

本發明提供的半纖維素酶活性高，產酶穩定，酶解條件較為溫和，產品產率高，純度高、雜質少、穩定性好。產酶及酶解工藝成熟，酶解成本低。


圖1為本發明產酶生產工藝流程圖。
圖2為本發明酶解生產工藝流程圖。
圖3、圖4、圖5為武漢大學測試分析中心對本發明方法製備的殼寡糖檢測分析結果(質譜分析)。
具體實施例方式
實施例1本發明所述半纖維素酶的製備1.將半纖酶A1號菌株用劃線法接種在含胰蛋白腖(Tryptone)1％ 酵母抽提物(Yeast extract)0.5％氯化鈉(Nacl)1％，瓊脂1％的平板培養基上，37℃溫度下培養18小時後使用；2.用1000ml的三角搖瓶裝100ml含中糊精10％，胰蛋白腖(Tryptone)1％酵母抽提物(Yeast extract)0.5％Nacl 1％的液體培養基，10磅滅菌20分鐘，接種一環，36℃搖床上振蕩(250r/min)培養18小時；3.在10升發酵罐內裝上8升含中糊精，胰蛋白腖，酵母抽提物組成的液體培養基，同上滅菌後接搖瓶種子懸液100ml於36℃下通氣攪拌培養24小時。
4.低溫離心分離酶液將發酵液裝入低溫冷凍離心機的離心桶中，蓋緊後，在+4℃條件下，以6000r/min轉速離心20分鐘，除去菌體等殘存物，取出上清液得本發明所述半纖維素酶酶液，置0-4℃低溫保存備用。
實施例2利用本發明提供的半纖維素酶生產殼寡糖1.工藝流程殼聚糖冰乙酸溶液→入罐酶解→離心、絮凝、過濾去雜質→脫色、脫異味→超濾分級→真空濃縮→噴霧乾燥→殼寡糖2.操作規程(1)酶解工藝將冰乙酸配製成2％的溶液，加入殼聚糖升溫攪拌溶解，溫度控制在48℃，殼聚糖與冰乙酸溶液的體積重量比(W/V)為10％。加入本發明所述半纖維素酶液降解，反應溫度48℃-50℃，保溫，攪拌，時間8小時；(2)離心過濾 將反應後的酶解液離心過濾，轉速3000r/min，時間15分鐘；(3)絮凝、澄清、二次過濾將離心液加入少量殼聚糖絮凝4-5小時，澄清後再離心過濾，轉速3000r/min，時間15分鐘；(4)脫色、脫異味 將二次離心清液通過大孔吸附樹脂進行脫色除味，流速1500ml/min，柱壓0.15mPa，溫度30℃；(5)超濾分級 通過超濾膜進行分子量截流，膜型號選用1K膜、3K膜，聚碸材質；將脫色好的粗聚寡糖液，先通過1K膜進行分子量截流除去單糖和雙糖，留取濃縮液(含殼3糖以上的殼低聚糖)；再將濃縮液通過3K膜進行分子量截流，留取透過液(含殼3-10糖)備用。(6)真空濃縮將超濾好的殼寡糖溶液通過真空薄膜蒸發器進行真空濃縮，真空度-0.08mPa，流速150-200L/hr，溫度60-65℃，濃縮液濃縮度控制在35％。(7)噴霧乾燥將濃縮液選用25型高速離心式噴霧乾燥機進行噴霧乾燥，進口風溫150℃，出口風溫85℃，真空度-0.03mPa，加熱功率36KW，進口流速25L/hr，通過旋風收集器收集殼寡糖乾粉。(8)包裝用纖維桶內襯聚乙烯袋包裝。
權利要求
1.一種短小芽孢桿菌(Bacillus Pumilus)的篩選培育品短小芽孢桿菌(BacillusPumilus)半纖酶A1號，其保藏號為CCTCC M201023。
2.一種半纖維素酶，其特徵在於它是短小芽孢桿菌(Bacillus Pumilus)半纖酶A1號CCTCC M201023的發酵產物。
3.權利要求2所述半纖維素酶的生產方法，包括微生物的發酵培養和除去菌體殘存物的分離純化，其特徵在於培養短小芽孢桿菌(Bacillus Pumilus)半纖酶A1號CCTCC M201023。
4.一種殼寡糖的製備方法，包括對殼聚糖酶解、酶解液的離心過濾、絮凝澄清、真空濃縮、過濾去雜質、脫色、脫味、超濾分級、乾燥，其特徵在於對殼聚糖酶解使用了權利要求2所述的半纖維素酶。
5.一種殼寡糖的製備方法，包括對殼聚糖酶解、酶解液的離心過濾、絮凝澄清、真空濃縮、過濾去雜質、脫色、脫味、超濾分級、乾燥，其特徵在於對殼聚糖酶解使用了用權利要求3所述方法生產的半纖維素酶。
全文摘要
本發明是關於一種半纖維素酶及其在製備殼寡糖中的應用，該半纖維素酶是短小芽孢桿菌(Bacillus Pumilus)半纖酶A1號CCTCC M201023的發酵產物；本發明殼寡糖的製備方法包括對殼聚糖酶解、酶解液的離心過濾、絮凝澄清、真空濃縮、過濾去雜質、脫色、脫味、超濾分級、乾燥，其特徵在於對殼聚糖酶解使用前述的半纖維素酶。本發明的貢獻在於提供了高效產酶菌株，且酶的活性大大提高，達300u/ml；酶解工藝效率高，僅需8－10小時；產物中有效組份含量高，殼3－10糖在70％以上。
文檔編號C08B37/00GK1396185SQ0111435
公開日2003年2月12日 申請日期2001年7月13日 優先權日2001年7月13日
發明者吳健 申請人:武漢東湖生物技術發展有限公司