一種提高球孢白僵菌孢子抗熱性的方法及其應用的製作方法

2023-05-18 17:26:46 1

專利名稱：一種提高球孢白僵菌孢子抗熱性的方法及其應用的製作方法
一種提高球孢白僵菌孢子抗熱性的方法及其應用
背景技術：
隨著人類對環境保護和自身健康的日益關注，大力推廣生物農藥已成為全球農藥產業發展的新趨勢。白僵菌作為一種廣譜性病原真菌，因其具有易於生產、寄主範圍廣、侵染期長、不傷害人和其他脊椎動物及可貴的流行潛力等優點而成為目前世界上研究和應用最多的為微生物農藥之一。本發明中所用的菌株(球孢白僵菌CCTCC No :M209238)對目前茶樹頭號害蟲—— 「假眼單胞小綠葉蟬」有顯著防治效果。然而，白僵菌孢子製劑在製備、保藏和使用過程中， 都會因受到熱損傷而導致孢子活性降低甚至死亡。其中，製備過程中的熱來自乾燥，保藏過程中的熱來自保藏環境，使用(田間應用)過程中的熱來自陽光照射或寄主的行為發熱。因此，提高白僵菌孢子的抗熱性，對提高其殺蟲率和生物防治效果至關重要。

發明內容
本發明所要解決的技術問題是提供一種提高球孢白僵菌孢子抗熱性的方法。為解決上述技術問題，提供如下技術方案將0. 1-0. 65g/mL甘露醇添加於球孢白僵菌的孢子懸浮液。所述球孢白僵菌(Beauveria bassiana)保藏於中國典型培養物保藏中心，保藏編號為CCTCC No :M209238，該菌株信息已在中國專利200910264664. 8中公開，公布日2010年 6 月 9 日，公布號 CN101724571A。優選添加甘露醇與葡萄糖和乳糖組成的混合物於球孢白僵菌的孢子懸液，其中 0. 15-0. 35g/mL 甘露醇、0. 15-0. 35g/mL 葡萄糖和 0. 15-0. 35g/mL 乳糖。甘露醇及含甘露醇的混合物添加方法為取適量的甘露醇或甘露醇與葡萄糖和乳糖組成的混合物於25mL試管中，加入9. 5mL 0. 05%的吐溫-80溶液，沸水浴並攪拌至糖類完全溶解，冰水浴冷卻後，加入0. 5mL 2 X IO9孢子/mL的孢子懸浮液，並用振蕩器將其混勻。孢子抗熱性的檢測方法1)將添加了甘露醇或甘露醇混合物的孢子懸浮液均勻混合液置於45°c恆溫水浴鍋中，水浴10min(同時震蕩)後，立即取出，置於冰水混合物中冰浴冷卻；2)將冷卻後的混合液轉移到250mL三角瓶中，再加入40mL 2. 5%麩皮浸出液，混勻，置於25°C，180r/min搖床中培養12h ；3)用膠頭吸管吸取一滴培養液，滴到血球計數板上，並於電子顯微鏡下檢測並計算其孢子萌發率(當芽管長度不小於孢子直徑時，該孢子視為已萌發)。本發明還提供了一種提高球孢白僵菌孢子抗熱性方法的應用，是將甘露醇或甘露醇、葡萄糖、乳糖的混合物添加於球孢白僵菌的孢子懸液後進行乾燥處理或田間噴灑，有利於提高白僵菌孢子的存活率或殺蟲率。本發明的有益效果如下球孢白僵菌孢子可用於防治茶葉小綠葉 蟬，其孢子抗熱性的提高，降低了孢子在製劑製備和保藏過程中的熱損傷，也增加了球孢白僵菌孢子在田間應用時對環境中高溫的抵抗能力，從而提高了白僵菌孢子的存活率和侵染率，進而提高其生物防治的效果。
具體實施例方式實施例1 孢子懸浮液以及營養液的製備孢子懸浮液的製備1)洗脫。本發明所用的菌種為球孢白僵菌Beauveria bassiana(保藏編號為 CCTCC No :M209238)，取適量新鮮發酵培養物於250mL的三角瓶中，加入適量0. 05%的吐溫-80溶液和適量玻璃珠，用玻璃棒將培養物搗碎，用振蕩器高速振蕩至少lOmin。2)過濾。振蕩後，用2-4層紗布過濾，收集濾液。3)離心。將濾液離心，條件為8000r/min、5min、4°C，棄去上清。4)復溶。將離心後的沉澱物轉移到一 50mL離心管中，加入20-40mL 0.05%的吐溫-80溶液和10顆玻璃珠，用振蕩器高速震蕩至少20min。5)計數。取ImL上述復溶後的孢子懸浮液，用0. 05%的吐溫-80溶液稀釋50-100 倍後，用血球計數板計數。6)稀釋。計數後，將原孢子懸浮液用0. 05%的吐溫-80溶液稀釋到2 X 109孢子 /mL，待用。麩皮浸出液(營養液)的製備稱取25g麩皮於鍋中，添加IOOOmL蒸餾水中，煮沸並攪拌，維持沸騰30min(以上)，冷卻後用2-4層紗布過濾，收集濾液，再用蒸餾水將濾液補足至IOOOmL,所得溶液即為濃度為2. 5%的麩皮浸出液，也是培養孢子懸浮液所用的營養液。115°C，15min滅菌，待用。對比例對照1 將IOmL 1 X IO8孢子/mL孢子懸浮液置於250mL三角瓶中，再加入40mL 2.5%麩皮浸出液，混勻，置於251，180171^11搖床中培養12h ；用膠頭吸管吸取一滴培養液，滴到血球計數板上，並於電子顯微鏡下檢測並計算其孢子萌發率(當芽管長度不小於孢子直徑時，該孢子視為已萌發)。對照2 將IOmL 1 X IO8孢子/mL孢子懸浮液置於250mL三角瓶中，再加入40mL 2. 5%麩皮浸出液並將3g甘露醇溶解於混合液中，混勻，置於25°C，180r/min搖床中培養 12h;用膠頭吸管吸取一滴培養液，滴到血球計數板上，並於電子顯微鏡下檢測並計算其孢子萌發率(當芽管長度不小於孢子直徑時，該孢子視為已萌發)。對照3 將IOmL 1 X IO8孢子/mL孢子懸浮液置於250mL三角瓶中，再加入40mL 2. 5%麩皮浸出液並將1. 5g甘露醇、1. 5g葡萄糖和1. 5g乳糖溶解於混合液中，混勻，置於 25°C，180r/min搖床中培養12h ；用膠頭吸管吸取一滴培養液，滴到血球計數板上，並於電子顯微鏡下檢測並計算其孢子萌發率(當芽管長度不小於孢子直徑時，該孢子視為已萌發)。結果見表1
表 權利要求
1.一種提高球孢白僵菌孢子抗熱性的方法，其特徵在於，將ο. 1-0. 65g/mL甘露醇添加於球孢白僵菌的孢子懸浮液。
2.根據權利要求1所述方法，其特徵在於，將0.15-0. 35g/mL甘露醇、0. 15-0. 35g/mL 葡萄糖和0. 15-0. 35g/mL乳糖添加於球孢白僵菌的孢子懸浮液。
3.根據權利要求1或2所述方法，其特徵在於，具體添加方法如下取適量的甘露醇或甘露醇與葡萄糖和乳糖組成的混合物於25mL試管中，加入9. 5mL 0. 05%的吐溫-80溶液， 沸水浴並攪拌至糖類完全溶解，冰水浴冷卻後，加入0. 5mL 2 X IO9孢子/mL的孢子懸浮液， 並用振蕩器將其混勻。
4.權利要求1所述方法的應用，是將甘露醇或甘露醇、葡萄糖、乳糖的混合物添加於球孢白僵菌的孢子懸液後直接田間噴灑或乾燥處理後應用。
全文摘要
本發明公開了一種提高球孢白僵菌孢子抗熱性的方法及其應用，可用於白僵菌孢子製劑製備、保藏和田間應用等領域，是將甘露醇或甘露醇與葡萄糖和乳糖的混合物添加於球孢白僵菌的孢子懸浮液。球孢白僵菌孢子可用於防治茶葉小綠葉蟬，其孢子抗熱性的提高，降低了孢子在製劑製備和保藏過程中的熱損傷，也增加了球孢白僵菌孢子在田間應用時對環境中高溫的抵抗能力，從而提高了白僵菌孢子的存活率和侵染率，進而提高其生物防治的效果。
文檔編號A01P7/04GK102304478SQ201110252908
公開日2012年1月4日 申請日期2011年8月30日 優先權日2011年8月30日
發明者劉龍, 堵國成, 李華祥, 李江華, 楊海泉, 陳堅 申請人:江南大學