L6細胞模型在評價改善胰島素抵抗藥物或食品中的用途的製作方法

2023-05-18 06:16:31 2

專利名稱：L6細胞模型在評價改善胰島素抵抗藥物或食品中的用途的製作方法
技術領域：
本發明涉及降血糖功能性食品細胞評價模型的一種新用途，具體來說是指該細胞模型在評價具有改善胰島素抵抗的藥物或食品的用途，屬醫藥和食品保健領域。
背景技術：
糖尿病是一種常見的內分泌代謝失常性疾病，具有併發症多、發病率較高的特點， 現已成為僅次於腫瘤和心血管疾病之後的第三大非傳染性疾病。我國學者提出糖尿病治療五套馬車的原則，其中飲食治療應該是這套車的駕轅之馬，飲食治療對糖尿病控制最為重要，因此尋找有效地治療糖尿病的新物質，特別是從天然資源中去篩選和研究降糖成分，已為國內外醫藥工作者所關注和矚目。目前對糖尿病人有保健作用的食物資源，按照降血糖功能因子的不同有黃酮類、萜類、多糖類、糖醇類、水溶性膳食纖維類、硫醚類、多肽類等有助於降血糖的物質資源，充分利用我國現有資源將為我國糖尿病的防治有所幫助。體內外模型是人類研究糖尿病、評價降血糖食品功效的重要手段，對此國內外研究人員已進行了大量工作，並取得了很大成績。由於糖尿病發病機制複雜，目前還沒有統一的糖尿病模型能夠完全應用於降血糖食品功效的評價。探討胰島素抵抗發生的機制及改善胰島素的物質的研究日益被人們所重視。但由於人體試驗的局限性不便於對胰島素抵抗的發生機制及其環節進行深入研究，因此，建立合適的體外細胞評價模型成為探討胰島素抵抗發生機制及評價降血糖功能因子已經成為國際上研究的熱點。

發明內容
本發明的目的是，提供一種快速、簡便、易於重複、價格低廉、便於控制的體外L6 肌細胞模型來評價藥物或食品改善胰島素抵抗的效果，為保健食品開發和功能評價提供一種新途徑。其中所述的改善胰島素抵抗藥物種類包括各種劑型的藥品。其中所述的改善胰島素抵抗食品種類包括各種劑型的保健食品或食品。本發明是發現了 L6肌細胞模型在評價藥品或食品改善胰島素抵抗的作用，發明了該細胞體外模型作為評價改善胰島素抵抗藥物或食品效果的用途。
具體實施方案以下通過細胞實驗來闡明本發明所述體外模型的成功建立。1材料與方法1. 1細胞、主要試劑大鼠L6骨骼肌細胞株購自中國醫學科學院細胞中心，[3H]標記的脫氧葡萄糖購自中國同位素公司。高糖DEME培養基、無糖無酚紅DMEM培養基、胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)、胰蛋白酶購自美國GIBCO公司。腫瘤壞死因子α (TNF- α )購自P印rotech公司，MTT、細胞鬆弛素B、胰島素購自Sigma公司，葡萄糖，鏈黴素、青黴素，葡萄糖測定試劑盒購自北京普利萊基因技術有限公司。1.2細胞培養用含10% FBS高糖DMEM培養基培養L6肌細胞，將製備好的L6細胞懸液用PBS洗滌2次，然後按3X IO5細胞/每孔的濃度接種於6孔細胞培養板中，在5% C02、37°C飽和溼度條件下培養36h，形成單層貼壁細胞，當L6細胞聚合至70%的時候，換為含有2% FBS的 DMEM培養基進行分化，每隔2天換液，直至細胞生長出肌管，用於實驗。1. 3 L6肌細胞胰島素抵抗模型的建立採用TNF- α體外誘導培養法建立L6肌細胞胰島素抵抗細胞模型。將6孔細胞培養板中已經分化好的肌細胞分為TNF-α誘導組和對照組，並設平行組用於判斷試驗過程中細胞活性。TNF-α誘導組每孔加入21111新配製的含有101^/1111鼠1順-0的無血清無酚紅培養液，對照組加入不含TNF- α的無血清無酚紅培養液，繼續培養Mh。1. 4胰島素抵抗L6細胞模型的鑑定1.4. 1葡萄糖消耗實驗採用葡萄糖氧化酶-過氧化物酶法(GOD-POD)法。將上述細胞用PBS洗滌2次， 加入含lOOng/ml人胰島素的培養液，5% C02、37°C飽和溼度條件下培養30min。加入葡萄糖5. 6mmol/l，繼續培養Mh。分別於6、12、24h取培養液上清，用葡萄糖檢測試劑GOD-POD 法測定培養上清中的葡萄糖含量。試劑I(Rl)與試劑2(似)按4 1比例混合配製成工作液，並平衡至測定溫度，6孔板每孔取10 μ 1培養上清入1. Oml工作液，同時設空白和標準管。混勻，37°C保溫5 lOmin，於500nm處測各管吸光度。測定管與標準管吸光度對比可計算出培養液殘存葡萄糖含量，單位為mmol/1。1.4. 2葡萄糖轉運實驗根據葡萄糖攝取測定方案，棄去培養液，磷酸鹽緩衝溶液(PBQ洗滌細胞2次，含牛血清白蛋白(BSA) 37°C孵育15min後，加入[3H]標記的脫氧葡萄糖至終濃度2. 5 μ Ci
孵育IOmin後並棄去，加入含lOmmol/L葡萄糖的冰PBS終止反應，並用冰PBS洗滌3次，將細胞融解於Immol/LNaOH中，收集融解的細胞，用夜閃儀計數其每分鐘衰變數。另設一組加 Ιθμπιο /L細胞鬆弛素B作為[3H]標記的脫氧葡萄糖的非特異性攝取率，所有數據減去此值，作為各組細胞的葡萄糖攝取率。每次實驗設3復孔，共重複3次實驗。1.5統計方法所有數據以均數士標準差(^hs)表示，採用SPSS軟體進行單因素方差分析，比較各劑量組與對照組的差異，顯著性界值P為0. 05。2 結果2. 1 TNF- α對L6細胞培養液的殘存葡萄糖含量影響由表1可見，在培養基不含胰島素的基礎狀態下，TNF-α誘導組培養液中殘存葡萄糖含量與對照組比較無統計學差異(P >0.05)；在培養液中加入胰島素後，在TNF-α刺激下，誘導組培養液中殘存葡萄糖含量均顯著高於對照組細胞(P < 0. 05)，並呈現時間依賴效應。雖然兩組培養液中殘存葡萄糖含量隨著胰島素濃度的升高而降低P < 0.05)，但 TNF-α誘導組的降低幅度顯著低於對照組。表1 TNF-α對細胞上清液中葡萄糖殘存量的影響(x±s)
權利要求
1.L6細胞模型在評價改善胰島素抵抗藥物或食品中的用途。
2.根據權利要求1所述的L6細胞模型在評價改善胰島素抵抗藥物或食品中的用途，其特徵在於所述的改善胰島素抵抗藥物種類包括各種劑型的藥物。
3.根據權利要求1所述的L6細胞模型在評價改善胰島素抵抗藥物或食品中的用途，其特徵在於所述的改善胰島素抵抗食品種類包括各種劑型的保健食品或食品。
全文摘要
本發明公開一種L6細胞模型評價改善胰島素抵抗藥物或食品中的用途。該模型具有快速、簡便、易於重複、價格低廉、便於控制等特點。將其應用於評價改善胰島素抵抗藥物或食品，具有重要的科學價值和經濟效益，為保健食品開發和功能評價提供一種新途徑。
文檔編號C12Q1/02GK102251011SQ20101017635
公開日2011年11月23日 申請日期2010年5月19日 優先權日2010年5月19日
發明者丁葉, 張召鋒, 戴小倩, 李勇, 王軍波 申請人:北京大學