一種基於特異性SS-COI引物的麗草蛉PCR快速檢測方法與流程
2023-05-09 04:59:02
本發明屬於分子生物學領域，涉及一種PCR檢測方法，具體為基於特異性SS-COI引物的麗草蛉PCR快速檢測方法。
背景技術：
麗草蛉(Chrysopa formosa Brauer)，脈翅目，草蛉科，主要分布於我國的黑龍江、遼寧、吉林、北京、河北、山東、山西、河南、湖北、天津、甘肅、新疆、上海、四川、陝西等地區。成蟲和幼蟲的捕食能力都很強，主要捕食蚜蟲、介殼蟲、紅蜘蛛和多種昆蟲卵，也捕食蛾類幼蟲等。是田間生物防治的主要捕食性天敵。
集團內捕食(Intraguild predation,簡稱IGP)作用是一種更為複雜的種間關係,廣泛存在於各種生態系中,充分認識IGP作用的內在本質和作用機理,對發展和完善更有效的生物防治理論和策略、增強生物控害的功能、推進生物防治工程的建設有重大的意義。而常規的腸道解剖、行為觀察等傳統研究方法不能準確評價草蛉之間的捕食作用。目前，對麗草蛉的特異性檢測的方法尚未建立。
同時，傳統的草蛉鑑定是依據形態的差異，需具有一定的專業知識才能準確鑑定，而通過聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction，PCR)技術進行鑑定只需常規分子生物學方面的知識就能解決，並且準確可靠、簡便快速。
技術實現要素：
本發明的目的是針對上述問題，提供一種基於特異性SS-COI引物的麗草蛉PCR快速檢測方法，具有檢測速度快的優點。
本基於特異性SS-COI引物的麗草蛉PCR快速檢測方法包括以下步驟：
(1)製備特異性SS-COI引物：根據麗草蛉的線粒體DNA序列(genbank:KJ592501.1)，設計一對麗草蛉的特異性SS-COI引物，其包括：
正向引物CfF5：5'-TAGTTTAAGTTTATTAATTCGGG-3』
反向引物CfR1：5'-TTGAAGATGCCAGTAATAAG-3』；
(2)提取樣品總DNA：在棉田採集麗草蛉，將單頭蟲體放入離心管中將其磨碎，用提取試劑盒提取單頭蟲體基因組溶液，將基因組溶液保存備用，進行PCR擴增時吸取基因組溶液作為DNA模板；
(3)以步驟2)提取的總DNA為模板，利用正向引物CfF5和反向引物CfR1進行PCR擴增反應；PCR反應體系以20μL計為：
(4)分析PCR產物：對PCR擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，如出現大小為250bp的DNA擴增條帶，則表明樣品為麗草蛉。
在上述的基於特異性SS-COI引物的麗草蛉PCR快速檢測方法中，所述步驟(1)中，通過genbank的KJ592501.1，結合DNA條形碼技術中的通用引物：
LepF1：(5'-ATTCAACCAATCATAAAGATATTGG-3』)和
LepR1：(5'-AAACTTCTGGATGTCCAAAAAATCA-3』)
擴增出麗草蛉的COI產物，進行多條引物設計，從中篩選出特異性SS-COI引物，即正向引物CfF5和反向引物CfR1。
在上述的基於特異性SS-COI引物的麗草蛉PCR快速檢測方法中，所述步驟(3)中PCR反應條件為：首先，94℃3分鐘；其次，94℃30秒，51℃30秒，72℃1分鐘，共45循環次；最後，72℃10分鐘。
與現有的技術相比，本發明的優點在於：採用SS-COI PCR技術檢測麗草蛉，該技術操作簡單、快速、高效，靈敏度較高，麗草蛉的DNA最低檢出濃度為0.143ng/μL。
附圖說明
圖1為本發明麗草蛉特異性引物CfF5/CfR1的PCR檢測結果圖。其中，M：100bp DNA ladder；1-64為表1中序號所對應昆蟲的擴增結果，-為陰性對照。
圖2為本發明麗草蛉特異性引物CfF5/CfR1的DNA濃度梯度檢測結果圖。其中，M：100bp DNA ladder；1-8為麗草蛉DNA原模板濃度89.54ng/μL依次4倍稀釋濃度梯度，-為陰性對照。
具體實施方式
如圖1、圖2所示，本方案包括以下步驟：
(1)製備特異性SS-COI引物：根據麗草蛉的線粒體DNA序列(genbank:KJ592501.1)，設計一對麗草蛉的特異性SS-COI引物，其包括：
正向引物CfF5：5'-TAGTTTAAGTTTATTAATTCGGG-3』
反向引物CfR1：5'-TTGAAGATGCCAGTAATAAG-3』；
(2)提取樣品總DNA：在棉田採集麗草蛉，將單頭蟲體放入1.5mL離心管中將其磨碎，用OMEGA Insect Genomic DNA Kit提取試劑盒(OMEGA公司，美國)提取單頭蟲體基因組溶液。將基因組溶液保存於-20℃備用，進行PCR擴增時吸取1μL溶液作為DNA模板；
(3)以步驟2)提取的總DNA為模板，利用正向引物CfF5和反向引物CfR1進行PCR擴增反應；PCR反應體系以20μL計為：
(4)分析PCR產物：對PCR擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，取8μL PCR擴增產物，用1％瓊脂糖凝膠電泳分離，經溴化乙錠染色後，於凝膠成像系統中，根據擴增產物的大小來鑑定麗草蛉，如出現大小為250bp的DNA擴增條帶，則表明樣品為麗草蛉。
在上述的基於特異性SS-COI引物的麗草蛉PCR快速檢測方法中，所述步驟(1)中，通過genbank的KJ592501.1，結合DNA條形碼技術中的通用引物：
LepF1：(5'-ATTCAACCAATCATAAAGATATTGG-3』)和
LepR1：(5'-AAACTTCTGGATGTCCAAAAAATCA-3』)
擴增出麗草蛉的COI產物，進行多條引物設計，從中篩選出特異性SS-COI引物，即正向引物CfF5和反向引物CfR1。
在上述的基於特異性SS-COI引物的麗草蛉PCR快速檢測方法中，所述步驟(3)中PCR反應條件為：首先，94℃3分鐘；其次，94℃30秒，51℃30秒，72℃1分鐘，共45循環次；最後，72℃10分鐘。
利用引物CfF5/CfR1，以麗草蛉DNA為模板，以麗草蛉同域的44種其他昆蟲(見表1)為對照進行SS-COI PCR擴增，結果如圖1所示。1、2泳道對應的麗草蛉擴增出了250bp的目的條帶，表明根據麗草蛉線粒體DNA CO1基因設計的SS-COI引物的特異性強，其250bp序列如SEQ ID No.3所示。
表1引物特異性檢測中所涉及的昆蟲種類
第二部分，引物CfF5/CfR1對麗草蛉最低檢出量的測定
按第一部分中的方法提取單頭麗草蛉基因組DNA，然後原模板濃度89.54ng/μL以5倍進行遞減稀釋至檢測不出條帶，取1μL作為PCR檢測的模板，進行PCR反應，PCR反應條件為：首先，94℃3分鐘；其次，94℃30秒，51℃30秒，72℃1分鐘，共45循環次；最後，72℃10分鐘。
利用引物CfF5/CfR1做最低檢出量的測定，麗草蛉的DNA最低檢出濃度為0.143ng/μL，結果如圖2所示。
本文中所描述的具體實施例僅僅是對本發明精神作舉例說明。本發明所屬技術領域的技術人員可以對所描述的具體實施例做各種各樣的修改或補充或採用類似的方式替代，但並不會偏離本發明的精神或者超越所附權利要求書所定義的範圍。
序列表:
SEQ ID No.1
CfF5: 5'- TAGTTTAAGTTTATTAATTCGGG -3』
SEQ ID No.2
CfR1: 5』- TTGAAGATGCCAGTAATAAG -3』
SEQ ID No.3
1 TAGTTTAAGT TTATTAATTC GGGCTGAATT AGGTCAACCA GGATCTTTAATTGGTGATGA
61 TCAAATTTAT AATGTAATTG TAACAGCACA TGCTTTTATT ATAATTTTTTTTATAGTAAT
121 ACCAATTGTA ATTGGAGGTT TTGGTAATTG ATTAGTACCT TTAATACTTGCGGCTCCTGA
181 TATAGCTTTT CCACGTATAA ATAATATAAG TTTTTGAATA CTTCCTCCTTCATTAACCTT
241 ATTACTGGCA TCTTCAA
SEQ ID No.4
LepF1：5'-ATTCAACCAATCATAAAGATATTGG-3』
SEQ ID No.5
LepR1：5'-AAACTTCTGGATGTCCAAAAAATCA-3』