一種抗生鏈黴菌及其活性產物製成的生物製劑與應用的製作方法

2023-05-23 22:23:41 1

專利名稱：一種抗生鏈黴菌及其活性產物製成的生物製劑與應用的製作方法
技術領域：
本發明屬於生物農藥研究領域，特別涉及一種抗生鏈黴菌及其活性產物製成的生物製劑與應用。
背景技術：
化學農藥因其能快速有效地抑制或殺死植物病原菌，所以人們長期以來主要依靠化學農藥防治植物病害，也使得病原菌的抗藥性顯著提高，從而導致化學農藥的防治效果降低甚至失效。在實際生產中，應結合不同的手段進行綜合防控，減少對化學農藥的依賴程度，延緩化學農藥的抗藥性產生。農用抗生素是一類高效、廣譜、無汙染的農藥。據統計世界上67%的抗生素產品都來自微生物，而其中2/3又來自放線菌。由於海洋放線菌在生理和遺傳背景上的特殊性，必定能產生結構新穎的代謝物質，因此海洋放線菌代謝物的研究越來越受到人們的重視。

發明內容
本發明的首要目的旨在探尋生物農藥的新來源，提供一種抗生鏈黴菌。本發明的另一目的在於提供上述抗生鏈黴菌的活性產物的製備方法。本發明的再一目的在於提供通過上述製備方法得到的抗生鏈黴菌的活性產物及其應用。本發明的目的通過下述技術方案實現一種抗生鏈黴菌(Sti^ptomyces antibioticu), 名禾爾為抗生鏈黴菌(Streptomyces antibioticu subsp. antialbonostocticus)H74-18，於2010年12月27日保藏在中國典型培養物保藏中心(湖北武漢大學內)，保藏編號為CCTCC M 2010364 ；所述的抗生鏈黴菌H74-18是從近海海泥和紅樹林分離的2000多種海洋放線菌中篩選出的具有對辣椒疫黴病菌(Phytophthora capsici)、黃瓜疫黴菌(Wiytophthora cucumisativus) > 黃瓜炭 Si 病(Colletorichum cucumisativus)禾口辣椒炭 Iil 病菌 (Colletotrichum capsici)具有較好抑制活性的菌株。所述的抗生鏈黴菌H74-18具有以下特徵①高氏一號培養基上基內菌絲和氣生菌絲豐茂，基絲不斷裂，孢子絲著生在氣生菌絲上，孢子絲柔曲，孢子光滑呈圓柱形，成熟的孢子鏈孢子個數在8個左右，沒有觀察到孢囊、孢核等結構；②在天門冬素、馬鈴薯塊、高氏合成一號、澱粉瓊脂、克氏等5種固體培養基上均生長良好，形成豐富的氣生菌絲和基內菌絲，氣絲灰白至暗灰色，基絲黃至棕紅色，但在察氏、澱粉銨培養基上只有少量白色氣絲生長，色素在高氏合成一號固體培養基、馬鈴薯塊上有部分擴散，在天門冬素、澱粉瓊脂上不擴散，在其它培養基不產色素；③生理生化為能使明膠液化，能水解澱粉，在纖維素上不生長，牛奶不腖化，也不液化，不產黑色素，能利用葡萄糖、甘露醇、鼠李糖、蔗糖、棉子糖和肌醇；④全細胞水解液含L，L-DAP(左旋)、甘氨酸，丙氨酸和天門冬氨酸，含有核糖和葡萄糖，無特徵性糖(糖型C)，細胞壁組份屬I型；⑤16S rDNA序列結果在GeneBank中進行同源性比較，發現菌株H74-18與Sti^ptomyces antibioticus EF063450處於同一分枝，親緣關係最近，同源性高達99. 9%，但其在培養特徵、生理生化特徵上與Sti^ptomyces antibioticus有較大差異，據其採集地點為新會崖門大橋，故鑑定菌株H74-18為抗生鏈黴菌崖門亞禾中(Streptomyces antibioticus subsp. yamensis)。一種抗黴素A18 (1)，從上述抗生鏈黴菌H74-18中分離得到，分子式為C28H41N2O9， 分子量為M9. 3，結構式如式I所示
權利要求
1.一種抗生鏈黴菌(Sti^ptomyces antibioticu)，其特徵在於名稱為抗生鏈黴菌H74-18，於2010年12月27日保藏在中國典型培養物保藏中心，保藏編號為CCTCC M 2010364。
2.一種抗黴素AlS(I)，從權利要求1所述的抗生鏈黴菌H74-18中分離得到，其特徵在於分子式為C28H41N2O9，分子量為M9. 3，結構式如式I所示
3.權利要求2所述的抗黴素AlS(I)的製備方法，其特徵在於包括如下步驟(1)抗生鏈黴菌H74-18的活化；(2)抗生鏈黴菌H74-18的發酵，具體為①種子液的製備將步驟(1)活化的抗生鏈黴菌H74-18接種到培養基中下 160 180rpm搖瓶培養48h，得到種子液；②發酵液的製備將種子液以體積百分比10%的接種量接至30L發酵罐中培養，初始 pH值7. 0 7. 2，發酵溫度為，攪拌速度為300r/min，培養72h ；所述的發酵培養基組成為酵母粉25g，玉米澱粉20g，海水精3g，CaC032g, KNO3 2g， .3H20 0. 66g, FeSO4 · 7H20 0. 02g, MgSO4 · 7H20 1. 03g,水定容至 1000ml, pH 值為 7. 4，於 115 121°C滅菌 30min ； (3)抗黴素AlS(I)的提取①發酵液8000r/min離心30min，收集菌體；菌絲體在pH值為3.0、體積百分比70%的乙醇中振蕩Mh，然後用乙酸乙酯萃取；萃取液減壓濃縮得到粗提物；②利用規格200-300目的矽膠柱對粗提物進行層析，採用幹法裝柱，石油醚乙酸乙酯梯度洗脫，梯度比例為體積比5 1、3 1、1 1和1 3，每個梯度為IOOOmL,洗脫速度為lOmL/min，每IOOmL收集一個樣品，分部收集洗脫液，得到40個組份，將第16 36組分合併，得到洗脫液A ；③將洗脫液A用按體積比3 1混合的石油醚/甲醇混合液萃取，得到去除大部分油脂後的物質，再過規格為50 100目的葡聚糖柱，甲醇氯仿梯度洗脫，梯度依次為體積比 9 1、7 1、5 1、3 1、1 1、2 1和4 1，每濃度梯度為500mL，洗脫的總體積是 3500mL，流速5mL/min，每IOOmL為一個組分；將第10至15組分合併，再用規格為200-300 目的矽膠柱層析分離，洗脫劑為體積比5 1混合的石油醚/丙酮溶液，總體積為200mL， IOmL收集一份，總共收集20個組分，將第10 11組分合併為組分E ；④將步驟③得到的組分E繼續用規格為200-300目的矽膠柱分離，洗脫條件為按體積比5 1混合的石油醚/丙酮溶液，洗脫總體積為200mL，每20mL收集一份，得到10個組份；⑤將步驟④得到的活性組份4減壓濃縮，得白色晶體S，將S溶解於按體積比1 1混合得到的石油醚/丙酮溶液中，置4°C冰箱重結晶。⑦採用高效液相色譜對組份S進行分離純化，收集峰面積大的餾份，得到抗黴素 AlS(I)；色譜條件色譜柱為C18反相矽膠柱，甲醇/水=50 50 ；流速1. OmL/min ；吸收波長320nm。
4.根據權利要求3所述的抗黴素AlS(I)的製備方法，其特徵在於步驟(1)中所述的活化的方式為使用斜面培養基於培養菌株H74-18，直至菌絲和孢子生長成熟。
5.根據權利要求4所述的抗黴素AlS(I)的製備方法，其特徵在於所述的培養基為改良的高氏一號培養基，組成如下可溶性澱粉20g, KNO3 lg，海水精3g，K2HPO4 · 3H20 0. 66g， FeSO4 · 7H20 0. 02g, MgSO4 · 7H20 1. 03g,瓊脂 16g，水定容至 1000ml，pH 值為 7. 2 7. 4，於 115 121°C 滅菌 30min。
6.一種生物製劑，包含權利要求2所述的抗黴素AlS(I)。
7.根據權利要求6所述的生物製劑，其特徵在於所述的生物製劑為抗黴素AlS(I)粉末、乳化劑和甲醇按質量比2 5 43混合均勻得到。
8.根據權利要求7所述的生物製劑，其特徵在於所述的乳化劑為土溫-80。
9.權利要求6 8任一項所述的生物製劑應用於防治辣椒疫病、黃瓜疫病、黃瓜炭疽病或辣椒炭疽病中的至少一種。
全文摘要
本發明公開了一種抗生鏈黴菌及其活性產物製成的生物製劑與應用。該抗生鏈黴菌是從2000多種海洋放線菌中篩選出的均對辣椒疫黴病菌、黃瓜疫黴菌、黃瓜炭疽病和辣椒炭疽病菌具有較好抑制活性的菌株，名稱為抗生鏈黴菌H74-18，於2010年12月27日保藏在中國典型培養物保藏中心，保藏編號為CCTCC M2010364。從該菌株中分離得到具有抑菌活性的抗黴素A18(1)，分子式為C28H41N2O9，分子量為549.3。將該抗黴素A18(1)和乳化劑、甲醇混合得到穩定性較好的生物製劑。該生物製劑噴施後12天，施用倍數500×防治辣椒疫病的效果為90.00％，防治黃瓜疫病的效果為86.67％，防治辣椒炭疽的效果為86.67％，防治黃瓜炭疽的效果為90.00％。
文檔編號C07D321/00GK102174440SQ201110030190
公開日2011年9月7日 申請日期2011年1月28日 優先權日2011年1月28日
發明者李培謙, 林壁潤, 沈會芳, 潘群英, 蒲小明 申請人:廣東省農業科學院植物保護研究所