人組織激肽釋放酶活性檢測試劑盒及其應用的製作方法
2023-05-14 09:42:21
人組織激肽釋放酶活性檢測試劑盒及其應用的製作方法
【專利摘要】本發明公開了一種人組織激肽釋放酶活性檢測試劑盒，其特徵在於：該試劑盒包括：1)包被特異性抗人組織激肽釋放酶克隆抗體酶標板；2)人組織激肽釋放酶融合蛋白TK-4T1標準品；3)BAEE工作液。本發明的試劑盒採用免疫與化學相結合的方法，利用人尿液或血漿樣本中的TK能與其特異性抗體結合的特性將其從樣本中分離出來，進而催化底物苯甲醯精氨酸乙酯鹽酸鹽(BAEE)發生化學反應。
【專利說明】人組織激肽釋放酶活性檢測試劑盒及其應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及人組織激肽釋放酶檢測領域，具體地指一種人組織激肽釋放酶活性檢 測試劑盒及其應用，用於檢測人組織激肽釋放酶的活性。
【背景技術】
[0002] 人組織激肽釋放酶（TK)是一類絲氨酸蛋白酶，能促進低分子激肽原釋放血管活 性肽從而發揮一系列生物活性作用，命名為KLK1。在人和動物的高血壓、心血管疾病和腎臟 疾病的模型中，均可見到TK含量的降低。我們在轉基因的動物模型中發現TK具有降低血 壓，改善胰島素抵抗，改善腎功能的作用。TK的水平在人的心血管疾病及腎臟疾病的發生發 展的過程中可能具有重要的預測價值。
[0003] 我們研究發現，TK的含量與腦卒中（缺血性腦卒中和出血性腦卒中）的發生呈劑 量反應的負相關關係，並且這種現象能獨立於傳統的心腦血管疾病危險因素而存在。因此， TK可能是卒中患者的一個獨立的保護因子。隨後我們對所有卒中患者進行的5年隨訪中發 現，血漿TK含量較高的患者具有較低的卒中復發率及較長的無事件生存時間。這說明TK 不僅與腦卒中的發生有關還可能具有預防卒中復發的作用，並且降低的TK含量還可能作 為腦卒中復發的預測因子。
[0004] 研究發現TK啟動子區的基因多態性與TK活性的降低及動脈的向心性重構密切相 關。因此，TK基因的遺傳變異可能會影響TK的表達、活性和功能改變。有文獻報導尿中TK 的活性與TK基因的遺傳變異及高血壓的發生密切相關。尿或血漿中的TK活性與腦卒中及 其他心腦血管疾病的關係尚無相關研究報導。而由於血漿中的成分複雜，不利於直接檢測 TK的活性，所以有必要來建立一種能定量檢測血漿中TK活性的試劑盒及其製備方法，從而 解決血漿中蛋白成分複雜不利於TK活性檢測的難題。
【發明內容】
[0005] 本發明所要解決的技術問題就是提供一種人組織激肽釋放酶活性檢測試劑盒及 其應用，該試劑盒通過利用TK能與特異性抗體發生反應的特性與TK能催化底物苯甲醯精 氨酸乙酯鹽酸鹽（BAEE)發生化學反應的特性相結合，從而解決血漿中蛋白成分複雜不利 於TK活性檢測的難題。
[0006] 為解決上述技術問題，本發明提供的一種人組織激肽釋放酶活性檢測試劑盒，該 試劑盒包括：
[0007] 1)包被特異性抗人組織激肽釋放酶多克隆抗體酶標板；
[0008] 2)人組織激肽釋放酶融合蛋白TK-4T1標準品；
[0009] 3)BAEE 工作液，
[0010] 其中，包被特異性抗人組織激肽釋放酶的克隆抗體酶標板中的抗TK的抗體為抗 IIP的單克隆抗體或者抗IIP的多克隆抗體。研究表明：抗原具有不同的抗原表位，不同的 抗原表位結合不同的抗體，針對人組織激肽釋放酶（TK)具有不同的抗原表位。當我們利用 已有的四種抗TK的抗體作為捕獲抗體製備反應板來檢測標準品中TK的活性時，只有將抗 IIP的兔抗作為捕獲抗體時製備的反應板所繪製的標準曲線對線關係良好。這說明只有用 抗IIP兔抗所製備的反應板能與TK結合的同時還能與BAEE發生反應。
[0011] 進一步地，所述試劑盒還包括：PBST稀釋洗滌液、稀鹽酸、當量濃度為3. 5N的氫氧 化鈉溶液、摩爾濃度為〇. 11M的氯化鐵溶液和摩爾濃度為0. 2M的鹽酸羥胺溶液中任意一種 或幾種。
[0012] 再進一步地，所述BAEE工作液的摩爾濃度為0. 05M。
[0013] 再進一步地，所述PBST稀釋洗漆液中Tween-20質量分數為1%，所述稀鹽酸的質 量分數為13. 73%，氫氧化鈉溶液的當量濃度為3. 5N、氯化鐵溶液的摩爾濃度為0. 11M和摩 爾濃度為〇. 2M的鹽酸羥胺溶液。
[0014] 本發明還提供了一種包被特異性抗人組織激肽釋放酶多克隆抗體酶標板的製備 方法，包括以下步驟：
[0015] 1)稱取碳酸鈉和碳酸氫鈉，溶液水中得到pH為9. 6且摩爾濃度為0. 05的碳酸鹽 緩衝液；即包被緩衝液：
[0016] 2)用上述包被緩衝液稀釋抗TK的克隆抗體至3200倍，得到抗體溶液；
[0017] 3)按每一孔加入100 μ 1的比例吸取抗體溶液，並將抗體溶液加入96孔的酶標板 內，在4°C條件下包被過夜，然後用BSA質量分數為1%的PBS液200μ 1於37°C封閉lh ;
[0018] 4)稱取磷酸二氫鉀、12水磷酸氫二鈉、氯化鈉。氯化鉀和吐溫-20製備得到 Tween-20質量分數為0. 1 %的磷酸鹽緩衝液PBST ;
[0019] 5)用步驟4)得到的PBST洗滌步驟3)中封閉的酶標板，用PBST洗滌2?3次，每 次3分鐘，拍幹並密封，即得到包被特異性抗人組織激肽釋放酶多克隆抗體酶標板。
[0020] 本發明還提供了試劑盒在檢測血漿及尿中TK活性的應用方法：包括以下步驟：
[0021] 1)稱取碳酸鈉和碳酸氫鈉，溶液水中得到pH為9. 6且摩爾濃度為0. 05的碳酸鹽 緩衝液；即包被緩衝液：
[0022] 2)用上述包被緩衝液稀釋抗TK的克隆抗體至3200倍，得到抗體溶液；
[0023] 3)按每一孔加入100 μ 1的比例吸取抗體溶液，並將抗體溶液加入96孔的酶標板 內，在4°C條件下包被過夜，然後用BSA質量分數為1%的PBS液200μ 1於37°C封閉lh ;
[0024] 4)稱取磷酸二氫鉀、十二水磷酸氫二鈉、氯化鈉。氯化鉀和吐溫-20製備得到 Tween-20質量分數為0. 1 %的磷酸鹽緩衝液PBST ;
[0025] 5)用步驟4)得到的PBST洗滌步驟3)中封閉的酶標板，用PBST洗滌2?3次，每 次3分鐘，拍幹並密封，即得到包被特異性抗人組織激肽釋放酶多克隆抗體酶標板；
[0026] 6)將步驟5)得到的酶標板置於4°C條件下孵育24h，然後用質量分數為1%的BSA 溶液封閉lh ;
[0027] 7)利用PBST稀釋洗滌液稀釋標準品和樣品，將稀釋後的標準品、樣品和空白對照 分別加入步驟6)中封閉好的酶標板中，並將酶標板置於37°C條件下反應60min ;
[0028] 8)向步驟7)的酶標板中加入BAEE工作液，在37°C條件下反應60min ;
[0029] 9)向步驟8)中的酶標板中加入氫氧化鈉和鹽酸羥胺的混合液，使之與未消耗的 BAEE充分反應；
[0030] 10)向步驟9)的酶標板中加入稀鹽酸終止反應後加入氯化鐵溶液顯色；
[0031] 11)通過酶標儀讀數並繪製標準曲線，同時計算出TK的活性。
[0032] 本發明的原理：
[0033] 本發明的試劑盒採用免疫與化學相結合的方法，利用人尿液或血漿樣本中的ΤΚ 能與其特異性抗體結合的特性將其從樣本中分離出來並使其吸附在聚苯乙烯板上，然後 ΒΑΕΕ經通過ΤΚ的醋介後作用，剩餘的ΒΑΕΕ與鹽酸羥胺及三氯化鐵作用生成有色物質，最後 通過酶標儀讀數並計算出樣本中ΤΚ的活性。
[0034] 本發明的有益效果在於：
[0035] 本發明試劑盒具有靈敏度高，其靈敏度為0. 040EU?1. 27Eu，特異性強，重複性好 的特點。人組織激肽釋放酶融合蛋白ΤΚ-4Τ1標準品為原核表達並純化的人組織激肽釋放 酶（ΤΚ-4Τ1融合蛋白）；利用該融合蛋白作為標準品，其標準曲線的相關係數高達0.993。 利用此試劑盒檢測了尿液樣本中的ΤΚ活性，比較了其復孔間的組內差異均值為2. 7%，其 於當日重複檢測ΤΚ活性後獲得的板內差異的均值為3. 8%。間隔6個月後再重複檢測這 些樣本中ΤΚ的活性，其板間差異為6. 9%。我們利用該試劑盒比較了尿液樣本分別保存在 4°C及-80°C時的板間差異為4. 7%。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0036] 圖1為人組織激肽釋放酶融合蛋白TK-4T1的SDS-PAGE圖；
[0037] 圖2為抗TK-4T1重組蛋白多克隆抗體（抗IIP的兔抗）的SDS-PAGE圖；
[0038] 圖3為不同抗體包被的酶標板檢測時ΒΑΕΕ的量與0D45(I值之間的標準曲線圖；
[0039] 圖4為不同抗體包被的酶標板檢測標準品與0D45(I值之間的標準曲線圖；
[0040] 圖5為使用TK活性檢測試劑盒檢測尿和血標本中TK活性差異圖。
【具體實施方式】
[0041] 為了更好地解釋本發明，以下結合具體實施例進一步闡明本發明的主要內容，但 本發明的內容不僅僅局限於以下實施例。
[0042] 人組織激肽釋放酶活性檢測試劑盒的製備
[0043] 1、試劑
[0044] 1)包被緩衝液（pH = 9. 6/0. 05碳酸鹽緩衝液）：
[0045]
【權利要求】
1. 一種人組織激肽釋放酶活性檢測試劑盒，其特徵在於：該試劑盒包括： 1) 包被特異性抗人組織激肽釋放酶克隆抗體酶標板； 2) 人組織激肽釋放酶融合蛋白TK-4T1標準品； 3. BAEE工作液； 其中，包被特異性抗人組織激肽釋放酶克隆抗體酶標板中的抗TK的克隆抗體為抗IIP 的單克隆抗體或者至少含有抗IIP的多克隆抗體。
2. 根據權利要求1所述的人組織激肽釋放酶活性檢測試劑盒，其特徵在於：所述試劑 盒還包括：PBST稀釋洗滌液、稀鹽酸、氫氧化鈉溶液、氯化鐵溶液和鹽酸羥胺溶液中任意一 種或幾種。
3. 根據權利要求1或2所述的人組織激肽釋放酶活性檢測試劑盒，其特徵在於：所述 BAEE工作液的摩爾濃度為0. 05M。
4. 根據權利要求2所述的人組織激肽釋放酶活性檢測試劑盒，其特徵在於：所述PBST 稀釋洗漆液中Tween-20質量分數為1%，所述稀鹽酸的質量分數為13. 73%，氫氧化鈉溶液 的當量濃度為3. 5N、氯化鐵溶液的摩爾濃度為0. 11M和摩爾濃度為0. 2M的鹽酸羥胺溶液。
5. -種包被特異性抗人組織激肽釋放酶多克隆抗體酶標板的製備方法，其特徵在於： 包括以下步驟： 1) 稱取碳酸鈉和碳酸氫鈉，溶液水中得到pH為9. 6且摩爾濃度為0. 05的碳酸鹽緩衝 液；即包被緩衝液： 2) 用上述包被緩衝液稀釋抗TK的克隆抗體至3200倍，得到抗體溶液； 3) 按每一孔加入100 μ 1的比例吸取抗體溶液，並將抗體溶液加入96孔的酶標板內，在 4°C條件下包被過夜，然後用BSA質量分數為1%的PBS液200 μ 1於37°C封閉lh ; 4) 稱取磷酸二氫鉀、十二水磷酸氫二鈉、氯化鈉、氯化鉀和吐溫-20製備得到Tween-20 質量分數為〇. 1 %的磷酸鹽緩衝液PBST ; 5) 用步驟4)得到的PBST洗滌步驟3)中封閉的酶標板，用PBST洗滌2?3次，每次3 分鐘，拍幹並密封，即得到包被特異性抗人組織激肽釋放酶多克隆抗體酶標板。
6. -種權利要求1?4任意一項所述的試劑盒在檢測血漿及尿中TK活性的應用。
7. 根據權利要求6所述的應用，其特徵在於：包括以下步驟： 1) 稱取碳酸鈉和碳酸氫鈉，溶液水中得到pH為9. 6且摩爾濃度為0. 05的碳酸鹽緩衝 液；即包被緩衝液： 2) 用上述包被緩衝液稀釋抗TK的克隆抗體至3200倍，得到抗體溶液； 3) 按每一孔加入100 μ 1的比例吸取抗體溶液，並將抗體溶液加入96孔的酶標板內，在 4°C條件下包被過夜，然後用BSA質量分數為1%的PBS液200 μ 1於37°C封閉lh ; 4) 稱取磷酸二氫鉀、12水磷酸氫二鈉、氯化鈉。氯化鉀和吐溫-20製備得到Tween-20 質量分數為〇. 1 %的磷酸鹽緩衝液PBST ; 5) 用步驟4)得到的PBST洗滌步驟3)中封閉的酶標板，用PBST洗滌2?3次，每次3 分鐘，拍幹並密封，即得到包被特異性抗人組織激肽釋放酶多克隆抗體酶標板； 6) 將步驟5)得到的酶標板置於4°C條件下孵育24h，然後用質量分數為1%的BSA溶 液封閉lh ; 7) 利用PBST稀釋洗滌液稀釋標準品和樣品，將稀釋後的標準品、樣品和空白對照分別 加入步驟6)中封閉好的酶標板中，並將酶標板置於37°C條件下反應60min ; 8) 向步驟7)的酶標板中加入BAEE工作液，在37°C條件下反應60min ; 9) 向步驟8)中的酶標板中加入氫氧化鈉和鹽酸羥胺的混合液，使之與未消耗的BAEE 充分反應； 10) 向步驟9)的酶標板中加入稀鹽酸終止反應後加入氯化鐵溶液顯色； 11) 通過酶標儀讀數並繪製標準曲線，同時計算出TK的活性。
【文檔編號】G01N33/543GK104049082SQ201410236082
【公開日】2014年9月17日 申請日期:2014年5月30日 優先權日:2014年5月30日
【發明者】冉曉, 張琴 申請人:華中科技大學同濟醫學院附屬同濟醫院