具有抗整合素活性的氟－烷基－環肽衍生物的製作方法
2023-05-06 01:55:21
專利名稱：具有抗整合素活性的氟－烷基－環肽衍生物的製作方法
此處描述的發明涉及具有抗整合素活性的氟-烷基-環肽衍生物，尤其涉及在肽鍵的氮上和/或C-α位上含有氟-烷基的環肽化合物，如下面的式(I)所示。此處描述的發明還涉及所述化合物的製備方法，其作為藥物、尤其作為整合素受體抑制劑、用作抗血管生成劑和抗轉移劑的用途，並涉及包含它們的藥物組合物。
背景技術：
整合素是參與細胞粘附現象的一類受體。它們是由兩個亞單位D和β組成的糖蛋白，亞單位結合以形成不同的家族。更詳細的描述請參見Kessler，H.，等人，Angew.Chem.Int.Ed.Engl.，1997，36，1374-89。
所有的整合素都具有「通用細胞識別位點」，能從鑑別三個胺基酸的第一個字母符號開始識別普通肽序列Arg-Gly-Asp，也稱為RGD，儘管每個整合素都優先識別這個三肽的不同構造(Kessler，H.，等人，J.Am.Chem.Soc.，1996，118，7461-72)。
β1整合素家族在組織的機化中起著重要作用，β2整合素對免疫系統很重要，而β3整合素調節血液凝固過程和血管生成。
藥物化學的一個目的是使能與整合素家族相結合、同時由於它們中的每一個在病理生理學水平所起的作用的差異而選擇性地作用於各種亞型的化合物為醫生所用。
此處描述的發明針對的是參與血管生成機制的整合素。
不同生長因子的作用刺激內皮細胞上整合素αVβ3(玻璃體結合蛋白受體)的表達。在隨之發生的內皮細胞朝血管生成刺激方向移行期間，含有αVβ3整合素受體的膜結合細胞外基質上的以不同形式存在的三肽序列RGD。這種結合導致了細胞骨架蛋白質——thalin、paxilin、α-輔肌動蛋白、tensin和vinculin型——的積聚。這使得作為內皮細胞生存信號的移行得以進行，同時新的血管形成。可溶解RGD類似物的給藥阻止了蛋白質在受體上的積聚，並導致程序性的細胞死亡(凋亡)，抵制了內皮細胞的移行，防止了新血管形成(Giannis，A.，等人，Angew.Chem.Int.Ed.Engl.，1997，36，588-90)。
在選擇性地參與血管生成的眾多分子中，整合素是癌症治療和所有與無法控制的新血管形成有關的疾病治療中最有希望的作用靶點。
這一課題最初的科學研究(Saiki，I.，等人，Jpn.J.Cancer Res.，1990，81668-675)報導了含有RGD序列的肽識別整合素、從而抑制腫瘤中血管生成的作用。
RGD三肽以這些受體的天然配體的形式存在，如玻璃體結合蛋白、纖維結合素和纖維蛋白原。
最近的研究已經顯示，在內皮細胞腫瘤的血管生成中，αVβ3和αVβ5型整合素增加，依靠抗體RGD環肽和RGD擬肽劑對αV整合素的抑制可以阻斷新血管形成(Arap，W.，等人，Current Opinion in Oncology，1998，10560-565)。β1整合素(α1β1和α2β1)在血管生成中也可能有作用，儘管它們的作用還需要進行徹底研究。
抗αVβ3抗體如LM609抗體(Vitaxin)的全身給藥阻斷了腫瘤的血管發生，降低了人乳腺癌的生長和侵襲特性(Brooks，P.C.，等人，J.Clin.Invest.，1995，961815-22)。
摻有RGD序列的小肽可以抑制很多整合素。這個序列在含有D-胺基酸的五元或六元肽環中的摻入通常可以得到有效的、選擇性的整合素抑制劑分子(Haubnev，R.，等人，J.Am.Chem.Soc.，1996，1187881-91)。
玻璃體結合蛋白是血管基質蛋白，是選擇性的αVβ3受體拮抗劑，而纖維蛋白原，另一種蛋白，則選擇性的與αIIbβ3受體結合。
到目前為止，對RGD類似物的研究主要針對的是αIIbβ3受體拮抗劑，它是有效的、選擇性的，可以口服。用作抗凝劑的一些非肽RGD類似物正在進行臨床試驗。
另一方面，作為抗血管生成劑，所需要的是能選擇性地抑制αVβ3和/或αVβ5受體而不影響αIIbβ3受體的RGD類似物。
關於抑制αVβ3受體的化合物的例子及其申請，請參見以申請人名義申請的EP 1 077 218，作為特別參考，也用於技術發展水平的進一步討論。
含有Arg-Gly-Asp(RGD)序列的環肽結構的例子描述在EP 0 596350，默克專利；Wer-muth，J.，等人，J.Am.Chem.Soc.，1997，119(6)，1328-1335；US 5.705.481，默克專利；WO 99/58162，Du Pont製藥公司；Liu，S.，等人，Bioconjugate Chemistry(2001)，12(4)，559-568；WO01/097860中。
此處描述的發明的一個目的是提供可以口服的αVβ3受體的選擇性激動劑，它以長期治療為有益特徵。
含有氟原子的天然化合物的例子是很少的。這個元素由於其物理化學性質(大小、電負性等)，可以賦予生物學活性的有機化合物以特殊的性質。
近年來，由於更多的可處理的氟化試劑可以利用，具有傑出特性的有機衍生物已經製備出來了，如吡哆醛依賴的酶(轉氨酶和脫羧酶)的胺基酸底物氟化時可用作特殊的滅活劑；氟化嘧啶具有抗癌活性；卡託普利的三氟甲基化類似物具有小於nM的活性；天然蒽環類抗生素的氟化類似物作為抗癌藥具有更大的活性(Giannini，G.，CurrentMedicinal Chem.，2002，91867-93)；三氟甲基化的腦啡肽類似物其效力已經增強了10,000多倍。RGD的氟化線性類似物被A.DalPozzo等人描述在J.Chem.Res.(s)468-469(1999)中。也請參見Ojima，L，Organofluorine Compounds in Medicinal Chemistryand Biomedical Applications；R.Filler(ed)，1993-ElsevierScience出版社；Ojima，L.等人，Biomedical Frontiers ofFluorine Chemistry-ACS Symposium Series 639(1996)；Sewald，N.等人，Amimo Acids(1995)8187-194。
胺基酸的烷基化是藥物化學很重要的方面。在整合素抑制劑領域中也有胺基酸N-烷基化的例子(Kessler，H.，等人，J.Med.Chem.，1999，42，3033-40)，其導致了被稱為EMD 121874(Cilengitide)的產品，是由默克開發的，正在進行II期臨床試驗。
更少見的是α-烷基化方法，儘管它也有潛在的希望。事實上，已知將Cα-二取代的胺基酸摻入肽的關鍵位置可以修飾和穩定二級結構(Marshall，G.R.，Int.J.Pept.Protein Res.，1998，32，544-5)。而且，氟取代氫可能會影響包含它的肽的蛋白水解穩定性和溶解度(Koksch，B.，J.Pept.Sci.，1997，3，157-67)。
烷基化後，隨後的階段是胺基酸的氟烷基化。這種情況也有線性寡肽氟烷基化的例子(Dal Pozzo，A.，等人，Tetrahedron，1998，54，6019-28；Koksch，B.等人，Biomedical Frontiers of FluorineChemistry；ACS Symposium Series 639，第3章，1996，42-58)。氟烷基化的肽有下列優點生理肽酶的保護，類似於烷基；疏水性極大增強(超過大多數烷基)，這增加了生物利用度(吸收和分布)；構型的剛性增加，是由於大小增加(其在溶液中比單一的甲基大)，賦予了氫鍵獨特的能力，這在其它優點中可能引起脲鍵周圍的旋轉受限。
本發明的另一個目的是提供在關鍵位置，C-α和/或N-位置上含有氟烷基化胺基酸的肽的合成方法，以及，儘管產生了新結構的空間體積和電子效應，仍然發現了這些化合物的生物學性質，例如αVβ3和/或αVβ5整合素受體的有效的選擇性抑制劑。
發明概述已經發現，式(I)化合物環[NX1-R1-CO-NX2-R2-CO-NX3-R3-CO-NX4-R4-CO-NX5-R5-CO]其中R1選自CH(CH2)3NHC(NH)NH2、C[CHnFm](CH2)3NHC(NH)NH2R2是基團CH2、CH2-CH2、
R3選自CHCH2COOH、C[CHnFm]CH2-COOH；R4選自CH-CH2-Ph、C[CHnFm]CH2-Ph、CH-CH2-(4-OH)Ph、CH-CH2-(4-OMe)Ph、CH-CH2-(4-F)Ph、CH-CH(OH)-Ph、C(CH3)2、CH-C(CH3)3、CH-CH2-COOH、 R5選自CH-CH2-Ph、C[CHnFm]CH2-Ph、CH-CH(CH3)2、C[CHnFm]CH(CH3)2、CH-C(CH3)3；或者NX4-R4-CO-NX5-R5-CO基團是3-氨基甲基-苯甲醯基n+m＝3X1-X5相同或不同，是H、(CH2)n-CH3、(CH2)n- CHF2、(CH2)n-CH2F、(CH2)n-CF3，其中，n＝0-3；條件是至少一個α-氟烷基化胺基酸存在於式(I)化合物中。
其中，每個NX-R-CO胺基酸可以具有R型或S型絕對構型；其各自的對映異構體、非對映異構體、相應的混合物、藥學可接受的鹽都是αVβ3和/或αVβ5整合素受體的選擇性抑制劑。
因此，本發明的目的是上述式(I)化合物，其製備方法，其作為藥物的用途以及包含它們的藥物組合物。
本發明的這些目的和其它目的還將以實施例進行詳細闡述。
發明詳述根據本發明，藥學可接受的鹽是本領域專家能夠製備的那些鹽，當所述鹽用作藥物時，不存在使用酸或鹼所引起的不希望出現的作用。
在本發明上下文中，優選下列化合物c(Arg-Gly-Asp-D-Phe-(R或S)-Tfm-Phe)(ST1930/ST1931)；c(Arg-Gly-Asp-D-Phe-(R，S)-Dfm-Phe)(ST1932)；c(Arg-Gly-(R或S)-Tfm-Asp-D-Phe-Val)(ST2189/2190)；c(Arg-Gly-Asp-(R或S)-Tfm-Phe-Val)(ST2191/2192)；c(Arg-Gly-Asp-D-Phe-(R或S)-Tfm-Val)(ST2409/ST2410)；c(Arg-Gly-Asp-D-Phe-(R或S)-N-Me-Tfm-Phe。
在更寬的方面，本發明提供了選擇性抑制由αVβ3和αVβ5整合素介導的細胞粘附到含RGD序列的配體的方法。另一個方面，本發明的目的是式(I)化合物在製備用於治療受異常血管生成影響的患者的藥物中的用途。本發明藥物用途的例子是減少轉移及治療視網膜病、急性腎衰竭和骨質疏鬆症。
另一個方面，本發明的目的在於上述化合物作為診斷劑的應用。特別地，當被適當標記以後，本發明化合物能用於小腫瘤塊的檢測和定位。類似地，所述標記化合物也能用於動脈閉塞疾病如中風或心肌梗塞的分析。
因此，本發明的另一個目的是上述式(I)化合物在製備診斷劑，尤其是腫瘤且優選小腫瘤塊，或動脈閉塞疾病如中風或心肌梗塞的檢測和定位的診斷劑中的用途。本發明覆蓋的也是含有至少一種式(I)化合物的診斷劑。關於本發明化合物的標記，這是本領域普通技術人員的普通專業知識的一部分，他或她基於其專業知識能夠選擇適當的標記物並能衍生本發明的化合物。本發明化合物的申請的例子可以參見WO99/11590和下列參考文獻Su，Z.F.，等人，Bioconjug.Chem.2002五月-六月，13(3)561-70；Haubner，R.，等人，Cancer Res.2001Mar 1，61(5)1781-5；Haubner R，等人，J.Nucl.Med.2001 Feb，42(2)326-36；van Hagen，P.M，等人，Int.J.Cancer 2000 Aug20，90(4)186-98；Sivolapenko，G.B.，等人，Eur.J.Nucl.Med.1998 Oct，25(10)1383-9；Pearson，D.A.，等人，J.Med.Chem.1996Mar 29，39(7)1372-82。
從化學的觀點來看，本發明在於獲得含有許多非天然胺基酸(氟烷基胺基酸)的肽結構的環化衍生物，其合成是已知的，並且已經進行了適當研究。
環肽是從羧酸酯形式的氟甲基化的胺基酸開始合成的，它與相應的N-保護的胺基酸的溴化物進行醯化。如此獲得的二肽酯水解以後，末端羧基與H-Orn(Cbz)-Gly-OtBu縮合。
去除了如此獲得的四肽的氮末端保護以後，它與Fmoc-Allgly-OH(天冬氨酸的前體)醯化得到全保護的線性五肽。兩個末端保護基去保護以後，經由TBTU進行環化作用繼續該過程，接著用高錳酸鹽氧化烯丙基殘基。最後一步包括鳥氨酸側鏈上的Cbz釋放，接著胺官能團胍基化，得到最終的環肽，它用RP-HPLC純化，分離兩個非對映異構體。
下面描述的是氟化胺基酸合成的一些製備實施例(構建組)製備1H-(R，S)-α-Tfm-Phe-OEt(Burger，K.，Gaa，K.，Chemiker Zeitung，1990，114，101-104)按照上面引用文獻中的描述製備該產品。
1H-NMR(CDCl3)δ7.33-7.18(m，5H，芳烴)，4.26(q，CH2-CH3)，3.45-2.95(dd，CH2-C6H5)，1.32(t，CH3)。
製備2H-(R，S)-α-Dfm-Phe-OEt(Bey，P.，Vevert，J.P.，Van Dorsselaer，V.and Molb，M.，J.Org.Chem.1979.44.2732-42)按照上面引用文獻中的描述製備該產品。
1H-NMR(CDCl3)δ7.28-7.13(m，5H，芳烴)，6.14-5.77(t，CHF2)，4.16(q，CH2-CH3)，3.20-2.87(2dd，CH2-C6H5)，1.21(t，CH3)。
製備3N-CH3-(R，S)-α-Tfm-Phe-OCH3(Buvger，K.and Hollweer，W.，Synlett.1994，751-3)按照上面引用文獻中的描述製備該產品。
1H-NMR(CDCl3)δ7.28-7.15(m，5H，芳烴)，3.73(s，OCH3)，3.27，3.22，3.16，3.12(q，CH2-C6H5)，2.47(s，N-CH3)。
這些合成組(構建組)被用於本發明的環肽的合成，所用的技術是本領域具有普通專業知識的技術人員所熟知的。
下列實施例進一步闡述了本發明。
縮略語TEA三乙胺；THF四氫呋喃；LDA鋰-異丙醯胺；DMF二甲基甲醯胺；溴烯胺1-溴-N，N-2-三甲基-1-丙烯基胺；HATUO-(7-氮雜苯並三唑-1-基)-N，N，N1，N1，N1-四甲基尿鎓(tetramethyluronium)六氟磷酸鹽；DIEA二異-丙胺；DCM二氯甲烷(dicloromethane)；DCC二環己基碳二亞胺；HOAT氮雜苯並三唑；allgly2-烯丙基甘氨酸；Tfm三氟甲基；Dfm二氟甲基；TBTUO-(苯並三唑-1-基)N，N，N1，N1-四甲基尿鎓四氟硼酸鹽。
實施例1C(Arg-Glv-Asp-D-Phe-(R或S)-Tfm-Phe)(ST1930/ST1931)Pht-D-Phe-Br的製備(Dal Pozzo，A.，Bergonzi，R.and Ni，M.H.，Tetrahedron Lett.，2001，42，3925-7)。
在氬氣下將1.4g(4.75mmol)Pht-D-Phe-OH溶解在19ml、0.5M的溴烯胺的DCM溶液中。10分鐘後，溶液就準備好可以使用了。
在12.5ml冷卻至0℃的溴化物溶液(如上製備)中加入248mg(0.950mmol)H-α-Tfm-Phe-OEt和可力丁(1當量)，室溫(a.t.)攪拌混合物，10分鐘以後加入另一份6.5ml溴化物溶液和1當量可力丁。2小時後乾燥混合物，用15ml 5％NaHCO3和15ml EtOAc萃取，並攪拌30分鐘。用水、1N HCl和水洗滌溶劑，接著蒸發並在閃式色譜柱上用8∶2的己烷-EtOAc作溶劑純化剩餘物。
將4.3ml 1M的BBr3的DCM溶液加到含有460mg二肽Pht-D-Phe-α-Tfm-Phe-OEt的21ml無水DCM溶液中，逆流濃縮加熱混合物2小時，然後用21ml水洗滌並乾燥。
將390mg酸肽(b)溶解在含有406.7mg(1.4當量)HATU和2.8當量DIEA的6ml無水CH3CN溶液中，攪拌15分鐘，之後加入548mg(2當量)HCl·H-Orn(Cbz)-OtBu和又一份2當量DIEA。2小時後，用15ml DCM稀釋反應，並用20ml鹽水萃取。用2N HCl、NaHCO3和水再次洗滌有機相。在閃柱色譜柱上用6∶4的己烷-EtOAc作溶劑純化剩餘物。
將上述獲得的424mg三肽溶解在2.2ml TFA/DCM(1∶1)中，30分鐘以後乾燥。
將283.8mg獲得的化合物溶解在5.7ml DCM中，加入HCl·H-Gly-OtBu(1當量)、DIEA(2當量)、HOAT(3當量)和DCC(3當量)。20分鐘後過濾混合物，用水、0.1N HCl、5％NaHCO3和水洗滌濾出物，然後乾燥。
將上述獲得的349mg四肽溶解在5ml EtOH中，加入含有600μl1M NH2-NH2·H2O的EtOH(1.5當量)溶液，逆流濃縮加熱反應2.5小時。除去EtOH，用10ml DCM和含有63.6mg Na2CO3(1.5當量)的10ml水溶液進行萃取。攪拌10分鐘以後，乾燥有機相，在閃柱色譜上用98∶2的CHCl3-MeOH純化剩餘物。
將134mg去保護的四肽溶解在2.7ml DCM中。加入Fmoc-AllGly-OH(1當量)、DIEA(1當量)、HOAT(1.2當量)和DCC(1.2當量)，然後如上所述進行反應。
將上述獲得的151.6mg五肽溶解在5ml DCM中，加入140μl哌啶。2小時後，用水、pH5.5的緩衝液、水、5％NaHCO3和水洗滌反應混合物，然後乾燥。在矽膠上過濾純化剩餘物，先用CHCl3洗滌，然後用95∶5 CHCl3-MeOH洗滌。
如上所述，在五肽的羧基末端去保護。
將116mg去保護的線性五肽溶解在86ml DMF中，加入TBTU(3當量)、HOBT(3當量)和DIEA(860μl)。5分鐘後乾燥混合物，用10ml DCM萃取剩餘物，用鹽水、2N HCl、水、5％NaHCO3和水洗滌溶液。
將上述獲得的80.9mg環五肽溶解在6.9ml丙酮中，冷卻溶液，逐滴加入KMnO4(620μl中含100.5mg)水溶液。在0℃保持1小時以後，反應混合物放在室溫下過夜。最後加入770μl 3N H2SO4和40％NaHSO3溶液，直到完全脫色。去除丙酮後，用水稀釋反應，用EtOAc萃取產物。
將66.8mg環五肽溶解在1ml 6∶4 DMF/AcOH混合物中，加入23.8mg甲酸銨(5當量)，然後加入33.4mg 10％Pd/C。15分鐘以後，用MeOH稀釋反應混合物，在Celite上過濾，乾燥濾出物。
將60.5mg完全去保護的環五肽溶解在540μl MeOH中，加入73μl DIEA(5當量)和49.8mg吡唑-羰脒(carboxamidine)一氯水合物(4當量)。1小時後，用TFA中和反應並乾燥。用預備的RP-HPLC在下列條件下對2個非對映異構體進行純化和同步分離柱Alltima(Alltech Italia)C18，10μm，250×22mm；流動相含34％乙腈的H2O+0.1％TFA；流動速率12ml/分鐘。
非對映異構體I(Rt 21.30)ST1930，非對映異構體II(Rt 26.76)ST1931，基於最後3個步驟計算的總產率33％。
非對映異構體I(ST1930)1H-NMR(CD3OD)δ7.30-7.19(m，芳烴)，4.70，4.28和4.08(m，α-CH)，3.80-3.15(CH2-Gly)，3.32(m，CH2-N)，3.15-2.80(m CH2-Asp+CH2-Phe+CH2-Tfm-Phe)，1.63-1.35(m，CH2-CH2-Arg)。
19F-NMR(CD3OD)δ5.18。
MS(M+H+)691.13。
非對映異構體II(ST1931)1H-NMR(CD3OD)δ7.23-7.20(m，芳烴)，4.85-4.05(m，α-CH)，4.30-3.75(2 dd CH2-Gly)，3.18(m，CH2-N)，3.50-2.50(m CH2-Asp+CH2-Phe+CH2-Tfm-Phe)，2.10-1.55(m，CH2-CH2-Arg)。
19F-NMR(CD3OD)δ4.17。
MS(M+H+)691.13。
實施例2c(Arg-Gly-Asp-D-Phe-(R，S)-Dfm-Phe)(ST1932)從H-(R，S)-Dfm-Phe-OEt開始，如實施例1中所述進行操作。得到還未拆分的兩個非對映異構體的混合物。
1H-NMR(CD3OD)δ8.00-7.05(d，NH)，7.35-7.15(m，芳烴)，6.42-5.6(t，CHF2)，4.74-4.32(m，α-CH)，4.32-3.96(2 dd，CH2-Gly)，3.68-2.50(m)，1.75-1.45(m，CH2-CH2-Arg)。
19F-NMR(CD3OD)δ-54.4到-55.5。
MS(M+H+)673.14。
實施例3c(Arg-Gly-(R或S)-Tfm-Asp-D-Phe-Val)(ST2189/2190)H-(R，S)-Tfm-Allgly-Oet與Pth-Gly-Br縮合，然後如實施例1中所述進行操作。用預備的HPLC、含22％CH3CN的水+0.1％TFA溶液拆分並純化兩個非對映異構體的混合物。
非對映異構體I(Rt 20.76)1H-NMR(DMSOD6+D2O)δ7.30-7.12，4.70，4.26，4.10，3.86，3.60-2.70，1.72，1.52-1.12，0.65。
MS(M+H+)643.2。
非對映異構體II(Rt 25.44)1H-NMR(DMSOD6+D2O)δ7.30-6.96，4.50，4.15，4.10-2.75，1.90，1.62，1.43-1.20，0.82。
MS(M+H+)643.2。
實施例4c(Arg-Glv-Asp-(R或S)-Tfm-Phe-Val)(ST2191/2192)HCl·H-(R，S)-Tfm-Phe-OEt與Pth-AllGly-Br縮合，然後如實施例1中所述進行操作。用預備的HPLC、含30％CH3CN的水+0.1％TFA溶液拆分並純化兩個非對映異構體的混合物。
非對映異構體I(Rt 17.19)1H-NMR(D2O)δ7.50-7.30，4.90，4.30-4.16，4.05，3.76-3.60，3.32-2.82，2.03-170，1.57，0.86，0.73。
MS(M+H+)643.2。
非對映異構體II(Rt 22.17)1H-NMR(D2O)δ7.48-7.12，4.75，4.25，4.07，3.75-3.10，2.95，2.10，1.85，1.63-1.00，0.77。
MS(M+H+)643.2。
實施例5c(Arg-Gly-Asp-D-Phe-(R或S)-Tfm-Val)(ST2409/2410)HCl·H-(R，S)-Tfm-Val-OEt與Pth-D-Phe-Br(是鹽酸鹽，共用3當量的可力丁)縮合。然後如實施例1中所述進行操作，直至獲得四肽Pht-D-Phe-(R，S)-Tfm-Val-Orn(Cbz)-Gly-OtBu。用閃柱色譜拆分兩個中間體非對映異構體[己烷-AcOEt＝4∶6]。
非對映異構體I(快速移動，Rf 0.23)非對映異構體II(緩慢移動，Rf 0.36)。
用兩個平行合成、採用與實施例1中描述的步驟相類似的步驟、分別處理兩個手性的純中間體產物非對映異構體I(ST2409)1H-NMR(D2O)δ7.37-7.25；4.83，4.73，4.46，4.13，3.47，3.21，3.08-2.69，2.33，1.92-1.50，1.08。
19F-NMR(D2O)δ10.50，0.97MS(M+H+)643.16。
非對映異構體II(ST2410)1H-NMR(D2O)δ7.37-7.29；4.87，4.73，4.56，4.46，3.53，3.18，3.00-2.55，1.87，1.60，1.18，0.85。
19F-NMR(D2O)δ9.29，0.97MS(M+H+)643.16。
實施例6c(Arg-Gly-Asp-D-Phe-(R或S)-N-Me-Tfm-Phe)[ST2552/2553] 末端羧基處的酯水解以後，與H-Orn(Cbz)-Gly-OtBu進行偶聯，然後用[Et3NH][Sn(SPh)3]還原疊氮基，在N-末端與Fmoc-Allgly縮合得到線性五肽。從這個中間產物開始，接著實施例1中所述繼續進行環五肽的合成。
與整合素αVβ3受體結合用0.5μg/ml整合素αVβ3(Chemicon，cat.CC1020)覆蓋96孔板過夜。第二天，洗滌各孔並用0.05nM(125I)Echistatin(Amersham，cat.IM304)在有或沒有本發明化合物存在的情況下進行孵育。3小時的孵育和一系列洗滌之後，與放射活性物質結合的各孔的整合素溶解在2N NaOH中，然後用伽馬計數器測量放射活性。在1μM Echistatin的存在下，檢測到了非特異的結合將從所有樣品中扣除。
與整合素αVβ5受體結合用1μg/ml整合素αVβ5(Chemicon，cat.CC1022)覆蓋96孔板過夜。第二天，洗滌各孔並用0.05nM(125I)Echistatin(Amersham，cat.IM304)在有或沒有本發明化合物存在的情況下進行孵育。然後和上面的情況一樣進行操作。
IC50參數的評價本發明化合物對玻璃體結合蛋白受體的親和力用IC50±SD值(nM)來表示，這是「ALLFIT」軟體詳細描述的參數。
下表1顯示了獲得的結果。特別地，ST2552顯示對玻璃體結合蛋白受體αVβ3和αVβ5都有高結合親和力。
表1化合物 αvβ3αvβ5IC50±SD(nM)ST1930 345±866.7±0.8ST1931 7238±1283 93±9ST1932 332±101 5.5±0.8ST2189 ＞10,000 ＞10,000ST2190 ＞10,000 ＞10,000ST2191 237±6410±1.9ST2192 1018±348 72.7±3.8ST2409 36.3±0.84 3.4±0.07ST2410 285.3±8.1 42.8±0.5ST2552 18.9±0.7 7.7±0.1ST2553 704.4±9.2 93.3±1.9
細胞培養從剛被處死並保存在冰裡直至送到實驗室的動物中分離來源於牛腎上腺的微脈管內皮細胞(牛微脈管內皮細胞——BMEC)。在無菌環境中，在聚維酮碘(betadine)溶液中洗滌腺體5分鐘，然後在2升無菌PBS中洗滌。然後用一次性無菌柳葉刀將腺體切成大約2mm的碎片，並轉移到含有PBS(每個腺體30ml)的聚苯乙烯Falcon試管中。在冷卻到+4℃的離心機中以600rpm離心分離後，傾析上清液。用0.12％膠原酶A溶液(Boehringer Mannheim)按1∶2將顆粒重新混懸，並於37℃攪拌孵育2小時。接著在過濾器(Sigma)上過濾，先是200目，然後是100目，將上清液加到含有15％FBS的DMEM溶液中，以抑制膠原酶A的作用。在室溫下以1000rpm離心分離溶液，沉澱物被重新混懸在含有20％FBS、50μg/ml牛腦提取物(BBE)、50μg/ml肝素(Sigma)、0.5％v/v慶大黴素(Sigma)和1％v/v L-穀氨醯胺的DMEM培養基中。在塗有1％明膠(Sigma豬明膠)的Petri皿中接種細胞。融合時，細胞以內皮標記因子VIII為特徵。
來源於美國典型培養物保藏中心(ATCC)的人黑素瘤MeWo細胞被放在含有10％FCS、2mM L-穀氨醯胺和50μg/ml慶大黴素的完全Eagle最低必需培養基(EMEM)中培養。
使SK-LMS-1人平滑肌肉瘤細胞(ATCC)在補充了10％FCS、2mML-穀氨醯胺和50μg/ml慶大黴素的EMEM中生長。
所有細胞都保存在37℃、含有5％CO2的潮溼環境中。
細胞粘附試驗在+4℃、用5μg/ml人玻璃體結合蛋白(Calbiochem)預處理96孔板12小時。用胰蛋白酶-EDTA分開BMEC或MeWo細胞，計數並鋪在玻璃體結合蛋白基質上。按0.1到100μM的梯度濃度分析分子，並與用於粘附的細胞共孵育。孵育後，用含Ca2+和Mg2+的PBS衝洗細胞一次，以去除沒有粘附到基質的那些細胞。在室溫下用4％多聚甲醛溶液固定粘附細胞10分鐘。然後在室溫下用1％甲苯胺藍溶液給細胞染色10分鐘。染色後，在雙蒸水中洗滌細胞，乾燥，並用1％SDS溶液溶解。然後根據在600nm處、在Victor多標記板計數器(Wal-lac)上讀到的吸光率對細胞進行計數。
分子活性的評價參數是IC50±SD值(μM)。
下表2顯示了從先前發現對玻璃體結合蛋白受體具有較大結合親和力的分子獲得的結果。特別地，ST2552分子顯示出以0.33μM的IC50值抑制MeWo人黑素瘤細胞粘附到玻璃體結合蛋白。
表2化合物 BMEC MeWo SK-LMS1IC50±SD(μM)ST1930 8.9±0.4 6.9±1.3 /ST1932 14.2±1.0 13.9±4.3 /ST2191 18.8±4.4 21.9±2.5 /ST2192 ＞100 / /ST2409 12.5±1.5 / 15.9±1.6ST2410 77.6±7.2 / ＞100ST2552 ＞100 0.33±0.05/本發明的另一個目的是，含有例如能產生顯著治療效果的量的至少一個式(I)化合物作為活性成分的藥物組合物。本發明包括的組合物完全是常規的，可以用藥物工業的普通方法獲得，例如，Remington′sPharmaceutical Science handbook，Mack Pub.N.Y.——最近的一版所闡述的方法。根據所選擇的給藥途徑，組合物可以是適於口服、胃腸外或靜脈內給藥的固體或液體形式。本發明的組合物連同活性成分一起，含有至少一種藥物可接受的載體或賦形劑。這些可能是尤其有用的製劑輔料，如增溶劑、分散劑、混懸劑和乳化劑。
權利要求
1.式(I)化合物環[NX1-R1-CO-NX2-R2-CO-NX3-R3-CO-NX4-R4-CO-NX5-R5-CO]其中R1選自CH(CH2)3NHC(NH)NH2、C[CHnFm](CH2)3NHC(NH)NH2R2是基團CH2、CH2-CH2、 R3選自CHCH2COOH、C[CHnFm]CH2-COOH；R4選自CH-CH2-Ph、C[CHnFm]CH2-Ph、CH-CH2-(4-OH)Ph、CH-CH2-(4-OMe)Ph、CH-CH2-(4-F)Ph、CH-CH(OH)-Ph、C(CH3)2、CH-C(CH3)3、CH-CH2-COOH、 R5選自CH-CH2-Ph、C[CHnFm]CH2-Ph、CH-CH(CH3)2、C[CHnFm]CH(CH3)2、CH-C(CH3)3；或者NX4-R4-CO-NX5-R5-CO基團是3-氨基甲基-苯甲醯基n+m＝3X1-X5相同或不同，是H、(CH2)n-CH3、-NX4-R4-＝ (CH2)n-CHF2、(CH2)n-CH2F、(CH2)n-CF3，其中，n＝0-3；條件是至少一個α-氟烷基化胺基酸存在於式(I)化合物中；其中，每個NX-R-CO胺基酸可以具有R型或S型絕對構型；其各自的對映異構體、非對映異構體、相應的混合物、藥學可接受的鹽。
2.根據權利要求1的化合物，選自下組c(Arg-Gly-Asp-D-Phe-(R或S)-Tfm-Phe)；c(Arg-Gly-Asp-D-Phe-(R，S)-Dfm-Phe)；c(Arg-Gly-Asp-(R或S)-Tfm-Phe-Asp-D-Phe-Val)；c(Arg-Gly-Asp-(R或S)-Tfm-Phe-Val)；c(Arg-Gly-Asp-D-Phe-(R或S)-Tfm-Val)；c(Arg-Gly-Asp-D-Phe-(R或S)-N-Me-Tfm-Phe。
3.權利要求1或2的化合物做為藥物的用途。
4.權利要求1或2的化合物在製備抑制屬於αvβ3和αvβ5系統的整合素家族受體的藥物中的用途。
5.根據權利要求4的用途，其中，所述藥物具有抗血管生成活性。
6.根據權利要求5的用途，其中，所述藥物具有抗轉移活性。
7.根據權利要求5的用途，其中，所述藥物能用於治療選自視網膜病、急性腎衰竭和骨質疏鬆症的疾病。
8.含有至少一個作為活性成分的權利要求1或2的化合物，與藥物可接受的載體和/或賦形劑混合的藥物組合物。
9.權利要求1-2的化合物用於製備診斷劑的用途。
10.根據權利要求9的用途，其中，所述化合物被標記。
11.根據權利要求9或10的用途，其中，所述診斷劑用於腫瘤塊的檢測和定位。
12.根據權利要求11的用途，其中，所述腫瘤塊很小。
13.根據權利要求9或10的用途，其中，所述診斷劑用於動脈栓塞疾病的檢測和定位。
14.根據權利要求13的用途，其中，所述疾病是中風或心肌梗塞。
15.含有至少一個權利要求1或2的化合物的診斷劑。
全文摘要
式(I)環[NX
文檔編號A61K38/00GK1662552SQ03814643
公開日2005年8月31日 申請日期2003年7月18日 優先權日2002年7月29日
發明者A·達爾波佐, G·吉安尼尼, C·皮薩諾 申請人:希格馬託製藥工業公司