一種在乳酸乳球菌中表達雞堆型艾美耳球蟲3-1e蛋白的方法
2023-04-30 14:13:31
專利名稱：一種在乳酸乳球菌中表達雞堆型艾美耳球蟲3-1e蛋白的方法
技術領域：
本發明涉及一種表達雞堆型艾美耳球蟲3-1E蛋白的方法。
背景技術：
雞艾美耳球蟲是嚴重危害養禽業發展的重要疾病之一。雞球蟲在體內繁殖過程中可導致上皮細胞發生損傷和炎症反應，廣泛損傷可引起雞發生腹瀉，脫水，體重喪失，直腸脫垂，痢疾等嚴重臨床疾病，有時可致雞死亡。全世界每年因球蟲病而造成的經濟損失約為30億美元，其中80%是由於雞增重下降、飼料轉化率降低及死亡等直接原因，20%是由於化學藥物研究的費用。已經證實頻繁使用化學藥物可導致耐藥性蟲株的出現，藥物殘留可帶來動物源性食品安全等問題。新型抗球蟲藥物研發的高額費用使製藥企業對開發新的抗球蟲藥物不感興趣。因此球蟲病的預防與控制已經成為丞待解決的重要課題。從研究趨勢 看，蟲苗預防必將會逐漸發展為防治雞球蟲病的主要手段。乳酸菌是人和動物腸道內常見益生菌，被公認為安全級(GRAS)微生物。乳酸菌作為表達外源蛋白的理想菌株安全、無毒，免疫途徑簡單。乳酸菌作為表達載體區別於其它未被歸於安全範圍內的活疫苗載體(如減毒沙門氏菌，大腸桿菌和痘病毒等)。乳酸菌載體本身不會引起強烈免疫應答，可以利用此載體對動物進行多次口服免疫。3-1E基因為雞艾美耳球蟲子孢子與裂殖子階段的表面抗原，蛋白分子量為18-27ku，序列全長1086bp，3-1E蛋白由170個胺基酸組成，在柔嫩艾美耳球蟲(E. tenella)、堆型艾美耳球蟲(E. acervulina)和毒害艾美耳球蟲(E. necatrix)之間均有很高同源性，可以作為基因工程疫苗的候選基因。但目前國內外尚無在乳酸乳球菌中表達雞艾美耳球蟲子孢子/裂殖子階段表面抗原3-1E的報導。
發明內容
本發明是要解決目前乳酸乳球菌中無法表達雞艾美耳球蟲子孢子/裂殖子階段表面抗原3-1E的問題，提供一種在乳酸乳球菌中表達雞堆型艾美耳球蟲3-1E蛋白的方法。本發明在乳酸乳球菌中表達雞堆型艾美耳球蟲3-1E蛋白的方法，按以下步驟進行—、將雞堆型艾美耳球蟲3-1E基因序列依照乳酸乳球菌的密碼子偏好性進行優化，得到人工合成的3-1E基因，並在其5'端和3'端分別引入BamH I和Xba I的識別序列，之後與克隆載體PUC57連接並轉化大腸桿菌DH5 α感受態細胞，篩選陽性轉化子PUC57-3-1E ；二、將pUC57-3-lE和大腸桿菌-乳酸菌穿梭表達載體ρΤΧ8048分別經BamH 2和Xba2雙酶切後，分別回收3-1E片段和載體片段，經T4 DNA連接酶連接後構建重組表達載體PTX8048-3-1E ；三、將ρΤΧ8048-3-1Ε經電轉化入乳酸乳球菌NZ9000的感受態細胞中，經篩選得到含有重組質粒的陽性重組乳酸乳球菌ΝΖ9000/ρΤΧ8048-3-1Ε，從陽性重組乳酸乳球菌中用質粒提取試劑盒提取質粒，之後針對步驟一中人工合成的3-1E基因序列設計引物，分別進行PCR鑑定，酶切鑑定以及序列測定；四、將NZ9000/PTX8048-3-1E接種於含氯黴素的GM17液體培養基中，經30°C厭氧培養過夜後，以I : 50的體積比轉接入含氯黴素的GM17液體培養基中進行擴增培養，300C厭氧培養至0D_為O. 4 O. 6，之後用10ng/ml的乳鏈菌肽繼續誘導培養3h，即完成了在乳酸乳球菌NZ9000中表達3-1E蛋白。雞艾美耳球蟲子孢子通過腸黏膜上皮細胞侵入機體內，子孢子表面的一系列分泌抗原可以刺激感染雞產生免疫應答。可以表達外源蛋白的乳酸菌所激發的免疫應答與球蟲的侵入途徑相似，可以激發動物體產生有效的腸道保護性免疫應答。本發明在乳酸乳球菌中表達雞堆型艾美耳球蟲3-1E蛋白，解決了應用其他一系列的乳酸菌表達載體均未能表達3-1E蛋白的問題。這將對今後研製基於雞源腸道共生乳 酸菌為宿主菌的乳酸菌口服疫苗研究奠定堅實的基礎。本發明將密碼子優化後的經人工合成的3-1E蛋白成功的在乳酸乳球菌NZ9000中進行了表達。
圖I為實施例的步驟三中PCR鑑定結果圖；圖2為實施例的步驟三中酶切鑑定結果圖；圖3為實施例中提取菌體總蛋白進行Western blot分析結果圖。
具體實施例方式本發明技術方案不局限於以下所列舉具體實施方式
，還包括各具體實施方式
間的任意組合。
具體實施方式
一本實施方式在乳酸乳球菌中表達雞堆型艾美耳球蟲3-1E蛋白的方法，按以下步驟進行一、將雞堆型艾美耳球蟲3-1E基因序列依照乳酸乳球菌的密碼子偏好性進行優化，得到人工合成的3-1E基因，並在其5'端和3'端分別引入BamH 2和Xba 2的識別序列，之後與克隆載體PUC57連接並轉化大腸桿菌DH5 α感受態細胞，篩選陽性轉化子PUC57-3-1E ；二、將PUC57-3-1E和大腸桿菌-乳酸菌穿梭表達載體ρΤΧ8048分別經BamH 3和Xba3雙酶切後，分別回收3-1E片段和載體片段，經T4 DNA連接酶連接後構建重組表達載體PTX8048-3-1E ；三、將ρΤΧ8048-3-1Ε經電轉化入乳酸乳球菌NZ9000的感受態細胞中，經篩選得到含有重組質粒的陽性重組乳酸乳球菌ΝΖ9000/ρΤΧ8048-3-1Ε，從陽性重組乳酸乳球菌中用質粒提取試劑盒提取質粒，之後針對步驟一中人工合成的3-1E基因序列設計引物，分別進行PCR鑑定，酶切鑑定以及序列測定；四、將ΝΖ9000/ρΤΧ8048-3-1Ε接種於含氯黴素的GM17液體培養基中，經30°C厭氧培養過夜後，以I : 50的體積比轉接入含氯黴素的GM17液體培養基中進行擴增培養，300C厭氧培養至0D_為O. 4 O. 6，之後用10ng/ml的乳鏈菌肽繼續誘導培養3h，即完成了在乳酸乳球菌NZ9000中表達3-1E蛋白。
步驟一中克隆載體pUC57購買自南京金斯瑞生物科技有限公司。步驟二中大腸桿菌-乳酸菌穿梭表達載體PTX8048已在《Microbial CellFactories,2011,10 66doi 10.1186/1475-2859-10-66, Expanding the moleculartoolbox for Lactococcus lactis -construction of an inducible thioredoxingene fusion expression system》即《微生物細胞工廠，2011,10 :66 doi 10. 1186/1475-2859-10-66，乳酸乳球菌分子工具盒的擴展-可誘導的含硫氧還蛋白基因的融合表達系統》中公開，由愛爾蘭考克大學van Sinderen D.教授饋贈。該載體的特點是引入了組氨酸標籤(6XHis)和硫氧還蛋白A(TrxA)，利於異源蛋白的融合表達。步驟三中乳酸乳球菌NZ9000購買自荷蘭NIZO研究所，其感受態細胞按照《ApplEnviron Microbiol, 1989 (55) :3119_3123》中的乳酸菌感受態製備方法製得。
具體實施方式
二 本實施方式是對具體實施方式
一所述的在乳酸乳球菌中表達雞堆型艾美耳球蟲3-1E蛋白的方法步驟二中PUC57-3-1E雙酶切做進一步的說明，步驟二中 PUC57-3-1E雙酶切的體系如下
權利要求
1.一種在乳酸乳球菌中表達雞堆型艾美耳球蟲3-1E蛋白的方法，其特徵在於在乳酸乳球菌中表達雞堆型艾美耳球蟲3-1E蛋白的方法，按以下步驟進行 一、將雞堆型艾美耳球蟲3-1E基因序列依照乳酸乳球菌的密碼子偏好性進行優化，得到人工合成的3-1E基因，並在其5'端和3'端分別引入BamH I和Xba I的識別序列，之後與克隆載體PUC57連接並轉化大腸桿菌DH5 α感受態細胞，篩選陽性轉化子pUC57_3_lE ； 二、將pUC57-3-lE和大腸桿菌-乳酸菌穿梭表達載體PTX8048分別經BamHI和XbaI雙酶切後，分別回收3-1E片段和載體片段，經T4DNA連接酶連接後構建重組表達載體PTX8048-3-1E ； 三、將ρΤΧ8048-3-1Ε經電轉化入乳酸乳球菌NZ9000的感受態細胞中，經篩選得到含有重組質粒的陽性重組乳酸乳球菌ΝΖ9000/ρΤΧ8048-3-1Ε，從陽性重組乳酸乳球菌中用質粒提取試劑盒提取質粒，之後針對步驟一中人工合成的3-1E基因序列設計引物，分別進行PCR鑑定，酶切鑑定以及序列測定； 四、將ΝΖ9000/ρΤΧ8048-3-1Ε接種於含氯黴素的GM17液體培養基中，經30°C厭氧培養過夜後，以I : 50的體積比轉接入含氯黴素的GM17液體培養基中進行擴增培養，30°C厭氧培養至OD6tltl為O. 4 O. 6，之後用10ng/ml的乳鏈菌肽繼續誘導培養3h，即完成了在乳酸乳球菌NZ9000中表達3-1E蛋白。
2.根據權利要求I所述的一種在乳酸乳球菌中表達雞堆型艾美耳球蟲3-1E蛋白的方法，其特徵在於步驟二中PUC57-3-1E雙酶切的體系如下成分川.M:PUC57-3-1E14pLIOxII Buffer4pLBamM I2μΕ Xba IddH20WpL 酶切反應條件為37 V反應3h。
3.根據權利要求I所述的一種在乳酸乳球菌中表達雞堆型艾美耳球蟲3-1E蛋白的方法，其特徵在於步驟二中表達載體PTX8048雙酶切的體系如下 成分表達載體PTX804814pL Κ.) N ,ιΠα4μΙBamH 22μΙ_ Xha 22pLddH20ISpL 酶切反應條件為37 V反應3h。
4.根據權利要求I所述的一種在乳酸乳球菌中表達雞堆型艾美耳球蟲3-1E蛋白的方法，其特徵在於步驟二中的連接體系如下
5.根據權利要求I所述的一種在乳酸乳球菌中表達雞堆型艾美耳球蟲3-1E蛋白的方法，其特徵在於步驟三中PCR鑑定的反應體系如下
6.根據權利要求I所述的一種在乳酸乳球菌中表達雞堆型艾美耳球蟲3-1E蛋白的方法，其特徵在於步驟四中含氯黴素的GM17液體培養基為含5 μ g/mL氯黴素和質量濃度.O.5%葡萄糖的M17肉湯培養基。
全文摘要
一種在乳酸乳球菌中表達雞堆型艾美耳球蟲3-1E蛋白的方法，涉及一種表達雞堆型艾美耳球蟲3-1E蛋白的方法。本發明是要解決目前乳酸乳球菌中無法表達雞艾美耳球蟲子孢子/裂殖子階段表面抗原3-1E的問題。方法將雞堆型艾美耳球蟲3-1E基因序列依照乳酸乳球菌的密碼子偏好性進行優化，插入克隆載體並轉化大腸桿菌感受態細胞，得陽性轉化子；將陽性轉化子和乳酸菌表達載體酶切後連接，構建重組表達載體；轉化乳酸菌感受態細胞，鑑定；進行重組菌培養及誘導，即完成在乳酸乳球菌NZ9000中表達3-1E蛋白。本發明將密碼子優化後的經人工合成的3-1E蛋白成功的在乳酸乳球菌中進行了表達。本發明方法用於球蟲病的預防領域。
文檔編號C12N15/74GK102816788SQ20121030258
公開日2012年12月12日 申請日期2012年8月23日 優先權日2012年8月23日
發明者馬德星, 馬春麗, 馮興軍, 高銘揚, 葛俊偉, 李廣興, 李一經 申請人:東北農業大學