作為用於治療惡性腫瘤的藥劑的異種寡或/和多核糖核苷酸的製作方法

2023-04-30 14:28:16 5

專利名稱：作為用於治療惡性腫瘤的藥劑的異種寡或/和多核糖核苷酸的製作方法
描述本發明涉及異種寡或/和多核糖核苷酸作為製劑用於治療惡性腫瘤。本發明還涉及異種寡或/和多核糖核苷酸在生產用於治療惡性腫瘤的藥物中的用途。
背景技術：
在60年代末和70年代初，在移植研究範圍內發現用異種異源核酸預處理的組織或弱抗原在多種不同的免疫學測試方法中顯示出基本上增加的抗滴度。這些結果用多種抗原在體外和體內研究中進行了進一步的確認。可是，沒有跡象表明異種來源的核酸尤其是寡或/和多核糖核苷酸可能適合於治療惡性腫瘤。
首先在USA，同時用指定的合成的多和寡核苷酸(尤其是核糖核苷酸)進行了實驗，可是其由於體內的高毒性而不再繼續研究。
因此本發明的目的是生產適合於治療惡性腫瘤的藥物。根據本發明，惡性腫瘤不包括惡性皮膚疾病。
本發明的目的是通過生產用於治療惡性腫瘤的藥物的方法來實現的，該藥物含有異種寡或/和多核糖核苷酸作為活性物質，並優選地以它們與待治療腫瘤的細胞的共軛物形式。
根據本發明，「異種的」表示核糖核酸來源自與將用其治療的生物體不同的生物體，也就是這樣的寡或/和多核糖核苷酸，即它們不來源自藥物將施於的同一個生物體。根據本發明而使用的異種寡或/和多核糖核苷酸優選地為那些來自動物組織(例如牛組織，胎牛組織)、植物和單細胞生物體(優選地來自酵母細胞，尤其是釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae))的核糖核苷酸。優選地使用在進化上離待測試的生物體儘可能遠的生物體的寡或/和多核糖核苷酸。因此，優選地在用於人的藥物中使用來自動物組織的RNA，或者特別優選地使用來自植物或單細胞生物體如酵母的RNA。
根據本發明所使用的寡或/和多核糖核苷酸為無毒的和它們單獨時不是抗原。
可以有效地使用總RNA及其鹽和化合物的製備物。tRNA是特別優選的。獲得可根據本發明而使用的RNA的特別優選方法為苯酚提取，特別是此處標明為方法I和II的方法。
此外，發現異種核糖核酸(RNA)聯合肽、多肽和蛋白質可增加其抗原性。基於這些觀察，不僅在體外和而且在體內用異種RNA處理相關患者的腫瘤組織。優選地在體外用異種RNA處理患者的腫瘤組織細胞，優選地用tRNA。然後將該混合物全身性地施用於該患者。在淺層惡性腫瘤的情況下，RNA也可以合適的蓋侖氏製劑形式進行局部應用。
除了用本發明的異種寡或/和多核糖核苷酸治療人以外，也可以這種方式治療溫血動物如馬、牛、綿羊等等。
下面的實施例和實驗結果進一步說明了本發明。
實施例實施例1根據本發明可用的寡或/和多核糖核苷酸的獲得相關的文獻描述了大量的獲取核酸、核苷酸和核苷的方法，其對於任何具有相關經驗的人員來說是已知的。這裡優選地應用兩種具有小修改的方法，它們都基於苯酚處理，方法I用於獲得總RNA(Georgiev，G.P.和Mantieva，V.L.，Biochim.Biophys.acta 61，153(1962))，和方法II用於獲得tRNA(Bauer，S.等人，Biotechnology andBioengineering 15，1081(1973))。這兩個方法都適合於較大量的提取。
方法I將釀酒酵母於緩衝液(A)(0.001M EDTA，0.01M Tris-HCl緩衝液(pH5-6)，25％蔗糖，0.5％SDS(十二烷基硫酸鈉)，0.3％脫氧膽酸鈉)中的15％懸浮液在韋林氏攪切器中並於10℃和3000rpm進行勻漿3分鐘。將勻漿物與相同體積的溶液(B)(於緩衝液(A)中的80％重結晶的苯酚，0.1％8-羥基喹啉，1.2％焦碳酸二乙酯)混和，然後於60℃緩慢攪拌30分鐘。所有的緩衝溶液用去離子水製備，該去離子水預先用皂土進行攪動。然後將苯酚處理的勻漿物於室溫(大約20℃)用10,000g離心15分鐘。移去水相，並將酚和中間相丟棄。將水相與相同體積的溶液(B)和氯仿/異戊醇(96∶4)的1∶1混合物進行混和，並按上面的描述進行提取。水相用一半體積的乙醚提取3次以除去剩餘的苯酚。將溶液調整至2％的乙酸鈉，並用2.5體積的無水乙醇沉澱RNA。
通過於0℃和5,000rpm離心來移除沉澱的RNA，並將其溶解在冰冷的0.01M Tris-HCl緩衝液(pH7.0)和0.001M MgCl2中。通過向溶液中添加電泳純的胰DNA酶(4μg/ml)並於22℃溫育3小時來降解可能存在的DNA。然後將蛋白質剩餘物即DNA酶和RNA酶用鏈黴蛋白酶(10μg/ml)於37℃消化3小時。在這期間，鏈黴蛋白酶也通過自身消化而被破壞。按照上面的描述用溶液(B)於60℃溫和地攪拌20分鐘來提取RNA溶液，通過離心來分離相，移除水相併用乙醚提取。在添加乙酸鈉(最終濃度為2％)之後，用2.5體積的乙醇沉澱RNA並通過離心將其移除。將沉澱物溶解在冷的2％乙酸鈉中，然後用2.5體積的乙醇沉澱，並讓其於-20℃留在醇混合物中過夜。然後通過離心移除沉澱，並用75％乙醇洗滌兩次，用無水乙醇洗滌兩次，和用乙醚洗滌兩次。在烘箱中乾燥之後，可獲得疏鬆乾燥的RNA，將其於室溫貯存在黑色玻璃容器中。
方法II該方法也適合於提取大量的酵母(千克的量)。
將給定重量的酵母在冷室中用4倍量的緩衝液(A)(見上面的方法I)進行勻漿。向勻漿物中加入40％v/v的苯酚溶液(B)和5％w/v由去離子水構成的冰塊，然後將混合物攪拌30分鐘。通過抽吸移除上清液，然後按方法I的描述用苯酚再處理兩次。將含水的上清液收集在一個容器中，該容器含有相當於所收集的上清液一半體積的DEAE-纖維素懸浮液(大約10％w/v，Whatman DE-22)。DEAE懸浮液通過攪拌保持懸浮狀態30分鐘。然後讓DEAE沉積1小時。通過抽吸移除上清液。在這期間，將中間相和酚相用等分量的溶液(C)(83％去離子水，15％w/v冰塊，2％乙酸鎂濃縮物(0.5M乙酸鎂於0.25巰基乙醇中))再攪拌兩次各30分鐘，然後讓其分離70-80分鐘。將含水的上清液轉移至含有DEAE的容器中，然後再次攪拌並讓其沉積。通過抽吸移除上清液，再如上所述洗滌DEAE，首先用溶液C洗滌兩次，然後再用溶液(D)(2體積的乙酸鎂濃縮物，2體積的NaCl濃縮物(3.75M NaCl的水溶液)，0.2體積的Tris-HCl濃縮物(2.5M Tris-HCl水溶液，pH7.5，96體積的水))洗滌一次。
然後將DEAE-纖維素裝入在底部封閉的柱中。所有的進一步步驟在4℃的冷室中進行。柱用12倍柱容量的溶液(D)進行洗滌，流速為1.4L/h，(只通過重力)。然後用溶液E(2體積的乙酸鎂濃縮物，0.2體積的Tris-HCl濃縮物，14體積的NaCl濃縮物和84體積的水，最終NaCl濃度為0.525M)洗脫tRNA，流速為3L/h。合併含有高於35A260nm單位/毫升的部分，並用1.5體積的乙醇沉澱。進一步的程序與方法I一致。
可選擇地，最終的沉澱物可以溶解在水中和可以凍幹。
該方法的一個變體為起始材料的通常的苯酚處理用異丙醇從上層相中沉澱出粗製的tRNA。在離心之後，用乙酸鈉緩衝液提取沉澱物並在DEAE-纖維素上進行色譜法。用乙酸鈉/氯化鈉梯度進行洗脫，這對於該方面有經驗的生物化學家來說是已知的。通過商數測量來確定合適的部分(見上)，並將其合併。用乙醇沉澱tRNA，將沉澱物如上溶解，優選地進行凍幹。
下面的測試是用於分析總RNA和tRNA的純度並用於表徵它們蛋白質根據Lowry，O.H.等人的方法(J.Biol.Chem.193，265(1951))和通過A260/A280≈2進行測定，DNA根據Dische的方法(Mikrochemie 8，4(1930))進行測定，總RNA根據Mejbaum的方法(Physiol.Chem.258，117(1939))進行測定，tRNA和胺基酸結合的定量測定根據Sprinzl和Sternbach的方法(Methods inEnzymology 59，182(1979))來進行，毒性根據M.Nldner的方法(個人通信)進行測定，致熱原的缺乏在體外根據DAB 1997(LAL測試)來確定和在體內根據Ph.Eur./DAB 1997來確定。
分析結果(總RNA和tRNA的特性，來自10個測試的平均值)吸收A260/A280≈1.94-2.0C、H、N分析C 32.67 32.42H 5.22 5.20N 2.29 2.00用多種總RNA和tRNA的相應值。
UV和IR光譜UV和IR光譜相應於生物物質而變化，它們幾乎相同，但不同一。分子量來自酵母的總RNA和tRNA≈22,000-27,000道爾頓平均值，對於不同的製備物而變化；蛋白質 DNA(總含量)2.3％neg.釀酒酵母細胞的總RNA1.9％neg.釀酒酵母細胞的tRNA0.9％neg.牛來源的總RNA平均值，一般通常的質量。經提高的純度不會導致顯著改善的治療作用，而同時導致不相稱的較高成本。
對於tRNA的胺基酸結合，10個分析的平均值賴氨酸 69-85pmol/A260單位苯丙氨酸 41-55絲氨酸 39-50纈氨酸 77-90這些平均值在不同批次的酵母中於規定的範圍內變化。
毒性小鼠中急性毒性測試動物 NMRI小鼠，雄性，Fa.Janvier，法國施用 以靜脈內方式進入尾靜脈觀察期間 24小時隨機樣品的數目n＝10，以最高濃度測試物質 a.牛總RNAb.來自醇酒酵母細胞的tRNA溶劑 0.9％NaCl的水(p.i.)溶液結果直至1g/kg/10ml i.v.的最大劑量，測試動物在24小時的觀察期間內絲毫沒有顯示出顯著的特徵。
致熱原的缺乏A.如已描述的，總RNA和tRNA的致熱原含量根據DAB 1997(LAL測試)用對於內毒素的體外測試來測定，和根據Ph.Eur./DAB 1997在兔上進行測定。
1.總RNA內毒素標準EC 5變形細胞溶解產物-公布的靈敏度0.06 EU/ml-測得的靈敏度0.06 EU/ml測試溶液100mg RNA溶解在20ml水-LAL(0.5％)中結果用水-LAL作0.5％1∶5稀釋的測試溶液的內毒素含量＜0.03EU/ml。
2.tRNA內毒素標準EC 5變形細胞溶解產物-公布的靈敏度0.06 EU/ml-測得的靈敏度0.06 EU/ml測試溶液100mg RNA溶解在20ml水-LAL(0.5％)中結果用水-LAL作0.5％1∶10稀釋的測試溶液的內毒素含量＜0.03EU/ml。
B.根據DAB/Ph.Eub.(2000標準)的致熱原缺乏的測試。
1.總RNA1％的測試物質於無致熱原的水(p.i.)中的測試溶液劑量1.0ml/動物動物3隻兔，根據DAB/Ph.Eub.(2000標準)結果3隻兔的溫度差異總和為1.05℃，因此不能檢測到致熱原。
2.tRNA1％的測試物質於無致熱原的水(p.i.)中的測試溶液劑量 1.0ml/動物動物 2次各6隻兔，根據DAB/Ph.Eub.(2000標準)結果a.6隻兔的溫度差異總和1.02℃b.6隻兔的溫度差異總和1.06℃，不能檢測到致熱原。
實施例2本發明物質的腫瘤效應的證明10名患各種癌的患者已做過外科手術，他們的身體已被許多的轉移侵襲並不再對於化療作出響應，治療他們的腫瘤學家判斷他們的生命只能持續幾個星期，用tRNA/腫瘤細胞共軛物(溫育大約30分鐘)全身性地治療這些患者，即將6×106腫瘤細胞與50-100mg tRNA，在14天內進行2次。
在這樣治療之後，一位女性患者還用溫和的化療進行支持性治療幾個星期。在差不多2年之後，她死於無關的基本疾病。
所有其他經治療的患者在無化療的情況下存活了＞1-2年，並且具有無副作用的良好生存質量。
這些結果證明在患者中使用這種RNA是適當的，特別是因為他們不幸地不再對於化療作出響應，而且在延長的生存期間絲毫沒有觀察到負作用或毒性效應。
權利要求
1.生產用於治療惡性腫瘤的藥物的方法，其特徵在於，異種寡或/和多核糖核苷酸被轉化成可全身性施用的形式。
2.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於，異種寡或/和多核糖核苷酸以它們與待治療腫瘤的細胞的共軛物形式進行使用。
3.根據權利要求2所述的方法，其特徵在於異種寡或/和多核糖核苷酸在體外與待治療腫瘤的細胞進行溫育，並將獲得的經溫育的材料作為活性物質使用。
4.根據前述的權利要求中任何一項所述的方法，其特徵在於，加入生理上可接受的賦形劑、輔助劑、稀釋劑或/和添加劑。
5.根據前述的權利要求中任何一項所述的方法，其特徵在於，活性物質包括來自動物組織、植物或/和單細胞生物體的寡或/和多核糖核苷酸。
6.根據權利要求5所述的方法，其特徵在於，活性物質包括來自酵母細胞的寡或/和多核糖核苷酸。
7.根據前述的權利要求中任何一項所述的方法，其特徵在於，活性物質包括異種tRNA。
8.根據前述的權利要求中任何一項所述的方法，其特徵在於，活性物質包括通過苯酚提取獲得的異種寡或/和多核糖核苷酸。
9.根據前述的權利要求中任何一項所述的方法，其特徵在於，異種寡或/和多核糖核苷酸來源於在進化上遠離待治療的生物體的生物體。
10.異種寡或/和多核糖核苷酸用於治療惡性腫瘤的用途。
11.異種寡或/和多核糖核苷酸以與待治療腫瘤的細胞的共軛物形式的用途，以實現權利要求10的目的。
12.根據權利要求11所述的使用，其特徵在於，使用已在體外與待治療的惡性腫瘤的細胞進行溫育的異種寡或/和多核糖核苷酸。
13.治療惡性腫瘤的方法，其特徵在於，將異種寡或/和多核糖核苷酸以50-100mg tRNA的有效量全身性地施用於需要如此治療的患者或動物。
14.根據權利要求13所述的方法，其特徵在於，tRNA以與待治療腫瘤的腫瘤細胞的共軛物形式進行施用。
15.根據權利要求14所述的方法，其特徵在於，105-108腫瘤細胞與50-100mg tRNA在體外溫育的混合物一次或幾次全身性地進行施用。
全文摘要
本發明涉及異種寡或/和多核糖核苷酸作為製劑用於治療惡性腫瘤。本發明還涉及異種寡或/和多核糖核苷酸在生產用於治療惡性腫瘤的藥物中的用途。
文檔編號A61K35/12GK1520304SQ02812860
公開日2004年8月11日 申請日期2002年6月26日 優先權日2001年6月28日
發明者B·梅斯裡姆勒, B 梅斯裡姆勒 申請人:I·P·L·國際製藥有限公司, I P L 國際製藥有限公司