一種具有促凝血作用的複方生物組分及其藥物製劑的製作方法

2023-04-23 01:59:11 2

專利名稱：一種具有促凝血作用的複方生物組分及其藥物製劑的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種具有促凝血作用的由蛇毒中分離提取的新的複方生物組分。和由它製成的新製劑，冷凍乾燥注射劑，特別是一種具有促凝血作用的複方生物組分及其藥物製劑。
背景技術：
臨床上各種病因引起的出血較為常見。如外科及矯形外科，胃腸道、腎、膀胱、前列腺及胸部手術；有創骨折出血、整容外科、顱腦腫痛、挫傷性出血。內科肝病出血、癌腫出血、痔血、肺出血、鼻出血。婦產科手術、子宮及陰道息肉，肌瘤及癌腫出血、放射治療後出血。泌尿科前列腺出血、前列腺切除、腎及膀胱出血。耳鼻喉科門診小手術預防，扁桃體切除，喉部手術。牙科、口腔科拔牙手術、顎部手術、齒齦炎出血。
目前臨床用止血藥除少量傳統化學藥如維生素K、氨甲環酸、卡巴克絡等大部分為生化藥物，如從動物血中提取的凝血酶，該藥為局部應用有一定局限，從動物器官中提取的抑肽酶，該藥抑制人體的胰蛋白酶及纖溶酶，從而保護纖維蛋白不被纖溶酶降解，起到間接的止血作用，使用這些藥品可能發生過敏，出現血清肌酐一過性增高等不良放應。另外還有瑞士進口從巴西矛頭腹蛇(Bothrops atrox)中提取的立止血，由低濃度降纖酶製成的巴曲亭等。

發明內容
本發明提供了一種一種具有促凝血作用的複方生物組分及其藥物製劑。它來源於蛇毒，療效確切，安全方便，止血效果好的新組分，特別是類凝血酶和類凝血激酶兩組分複方起到協同促凝血作用和由它製成的冷凍乾燥注射劑，該注射劑由蛇毒提取的複方生物組分和可接受的載體組成。
本發明的內容是一種具有促凝血作用的複方生物組分及其藥物製劑，其特徵在於由類凝血酶和類凝血激酶複方的具有促凝血和止血的多組份生化製劑，由以下配比的生化組份及輔料製成類凝血酶0.005IIU-1IU 類凝血激酶0.03IU-2IU 甘氨酸5mg-50mg甘露醇10mg-50mg 白蛋白0.1mg-1mg。
其中IU為效價單位。
所述的一種具有促凝血作用的複方生物組分及其藥物製劑，其特徵在於由以下配比的生化組份及輔料製成類凝血酶0.05IU-0.1IU 類凝血激酶0.3IU-1IU 甘露醇30mg 甘氨酸20mg。
所述的一種具有促凝血作用的複方生物組分及其藥物製劑，其特徵在於由以下配比的生化組份及輔料製成類凝血酶0.05IU-0.1IU 類凝血激酶0.3IU-1IU 甘露醇30mg 白蛋白0.2mg。
所述的一種具有促凝血作用的複方生物組分及其藥物製劑，其特徵在於生化組份及輔料製成各種劑型。
所述的一種具有促凝血作用的複方生物組分及其藥物製劑，其特徵在於生化組份及輔料製成製劑是注射劑、噴霧劑、塗劑。
所述的一種具有促凝血作用的複方生物組分及其藥物製劑，其特徵在於生化組份及輔料製成製劑是注射劑是冷凍乾燥製劑。
所述的一種具有促凝血作用的複方生物組分及其藥物製劑製備方法，其特徵在於，包括以下步驟a.類凝血酶提取、分離、純化精製；b.類凝血激酶提取、分離、純化鑑定；c.將上述生化組份按一定比例複合具有協同促凝血和止血作用並與可接受的載體混合製成一定生化製劑；d.在GMP條件下，經泠凍乾燥成品。
所述的一種具有促凝血作用的複方生物組分及其藥物製劑製備方法，其特徵在於，步驟a中的分離純化採用體積排阻色譜和離子交換層析技術。
所述的一種具有促凝血作用的複方生物組分及其藥物製劑製備方法，其特徵在於，步驟c中的藥物可接受載體是白蛋白，甘氨酸和甘露醇。
步驟a中的分離純化採用體積排阻色譜和離子交換層析技術。
步驟c中的藥物可接受載體是白蛋白，甘氨酸和甘露醇。
本發明的優點是全世界有大量的蛇資源，人類對其毒液的研究與應用已有幾百多年的歷史，早在1767年FoIUtaIUa就敘述了蛇毒的凝血作用與抗凝作用。本發明由蛇毒中分離提取新的生物組分複方而成，止血效果好，副作用小，是一種有效、安全的新型止血藥物。
本發明的複方生物組分是由長白由白眉蝮蛇(Agkistrodon.halys)或尖吻蝮蛇(AgkistrodonacIUtIUs)蛇毒中提取的蛋白水解酶-類凝血酶和蝰蛇毒(Vipera rIUsselli siamensis)提取的凝血X因子激活劑-類凝血激酶組成的。
類凝血酶在高劑量時(5IU-10IU)具有脫纖維蛋白原作用，而在低劑量時(＜1IU)具有明顯的止血作用。因子X激活劑——類凝血激酶在Ca2+離子存在下能激活血漿中因子X，使之轉變為有活性的Xa，在Xa的促進下，將凝血酶原轉變為凝血酶，在凝血酶的作用下將纖維蛋白原轉化為纖維蛋白達到止血目的。
具體實施例一種具有促凝血作用的複方生物組分及其藥物製劑，由類凝血酶和類凝血激酶複方的具有促凝血和止血的多組份生化製劑，由以下配比的生化組份及輔料製成類凝血酶0.005IU-1IU 類凝血激酶0.03IU-2IU 甘氨酸5mg-50mg甘露醇10mg-50mg 白蛋白0.1mg-1mg。
由以下配比的生化組份及輔料製成類凝血酶0.05IU-0.1IU 類凝血激酶0.3IU-1IU 甘露醇30mg 甘氨酸20mg。
由以下配比的生化組份及輔料製成類凝血酶0.05IU-0.1IU 類凝血激酶0.3IU-1IU 甘露醇30mg 白蛋白0.2mg。
生化組份及輔料製成各種劑型。
生化組份及輔料製成製劑是注射劑、噴霧劑、塗劑。
生化組份及輔料製成製劑是注射劑是冷凍乾燥製劑。
一種具有促凝血作用的複方生物組分及其藥物製劑製備方法，其特徵在於，包括以下步驟a.類凝血酶提取、分離、純化精製；b.類凝血激酶提取、分離、純化鑑定；c.將上述生化組份按一定比例複合具有協同促凝血和止血作用並與可接受的載體混合製成一定生化製劑；d.在GMP條件下，經泠凍乾燥成品。
本發明還包括，用本發明的複方生物組分和可接受的載體製成的冷凍乾燥注射液及在止血等方面的應用。
本發明的冷乾粉針注射液配方組成如下類凝血酶0.005-1IU 類凝血激酶0.03IU-2IU 和甘氨酸5mg-50mg 甘露醇10mg-50mg 白蛋白0.1mg-1mg優選的處方是類凝血酶0.05IU-0.1IU 類凝血激酶0.03IU-1IU 甘露醇30mg 甘氨酸20mg更為優選的處方是類凝血酶0.05IU-0.1IU 類凝血激酶0.03IU-1IU 甘露醇30mg 白蛋白0.2mg以上組成中，類凝血酶的單位定義依據為國家藥品標準WS1-XG-031-2000，類凝血激酶單位定義依據文獻BIOCHIM.BIOPHYS.ATCA，252(1971)255-261，白蛋白、甘露醇、甘氨酸是mg為單位。
以上組成是按體積重量比作為配比的，在生產時可按照相應比例增大或減少，如大規模生產，可以放大1000倍，10000倍，100000倍……。但各組成之間的重量/體積比例不變。
以上配比是經過科學篩選得到的，特殊情況下，比例可以調整。
本發明的複方生物組分，在製備成藥劑時加入藥物可接受的載體包括白蛋白、甘露醇、多糖、甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、胱氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸、賴氨酸、精氨酸、酪氨酸、脯氨酸、色氨酸、組氨酸、水解蛋白、明膠、右旋糖苷等。
本發明的藥物製劑可以是任何可實現的藥用劑型，這些劑型包括注射劑(冷凍乾燥)、噴霧劑、塗劑等。優選的是冷凍乾燥注射液。該注射劑可以皮下注射、肌肉注射或靜脈注射。
本發明的注射劑在使用時根據病人的情況確定用法，用量，可每日一次，每次1-2凝血單位，重症出血者，每次1-3凝血單位，每6-8小時用藥1次，1日的最大量不超過8凝血單位為宜，本品也可外用。本處凝血單位參考立止血單位定義。
本發明類凝血酶提取舉例如下取長白山白眉蝮蛇(Agkistrodon.halys)毒液的冷凍乾燥品用水配成5％的溶液，離心(10000rpm、15min)取上清液，加固體硫酸銨到45％飽和度，用2mol/LNH4OH調PH到7.0，4℃靜置過夜，離心(10000rpm、15min)，收集沉澱，用PH7.50.01mol/LTris-HCl緩衝液溶解，用截留分子量10000的超濾器脫鹽、濃縮。用DEAE-Sepharose FF層析(用PH7.50.01mol/LTris-HCl緩衝液平衡)，洗脫時用含0-0.5mol/LN4Cl的PH7.50.01mol/LTris-HCl緩衝液直線剃度洗脫，流速0.6ml/min，208nm波長檢測，部分收集，取有活性部分，適當濃縮，繼續用Sephadex G-25層析，用PH7.50.0lmol/LTris-HCl緩衝液平衡、洗脫，取有活性部分，用截留分子量10000的超濾器脫鹽、濃縮、凍幹。用國家藥品標準WS1-XG-031-2000中所述比活力測定法檢測活性組分，取比活力大於1200單位的組分。

本發明類凝血激酶提取舉例如下取廣西蝰蛇毒(Vipera rIUsselli siamensis)1g溶解於5ml PH5.50.05mol/L醋酸鈉緩衝液中，離心(10000rpm、15min)取上清液用Sephadex G-25層析，用PH5.5 0.05mol/L醋酸鈉緩衝液洗脫，流速0.5ml/min，收集活性部分，用截留分子量10000的超濾器脫鹽、濃縮，繼續進行QAE-Sephadex A-50層析(已用PH7.50.05mol/LTris-H3PO4緩衝液平衡)，洗脫條件為PH6.0 0.05mol/LTris-H3PO4緩衝液和含0.5mol/L的PH6.0 0.05mol/LTris-H3PO4緩衝液線性剃度洗脫，流速0.5ml/min，收集活性部分，用截留分子量10000的超濾器脫鹽、濃縮、凍幹。
本發明的兩生化組分的複方組合過程類凝血酶按國家藥品標準WS1-XG-031-2000方法測定，要求效價大於1200單位。類凝血激酶按文獻BIOCHIM.BIOPHYS.ATCA，252(1971)255-261測定，要求效價大於5000單位。按類凝血酶0.05IU和類凝血激酶0.03IU的比例將兩者混合，根據需要用去離子水配成不同濃度的溶液，經過0.45μm孔徑的醋酸纖維素膜過濾，液體冷凍乾燥成為本發明權利要求所指的一種有促凝作用的複方生物組分。
用上述複方生物組分製成冷凍乾燥注射液舉例
按處方量取複方生物組分和冷凍乾燥賦形劑，分別用400ml新鮮冷至20～30℃注射用水溶解後，調節液體pH到6.0～7.0。用10000截留分子量平板切向流超濾器除菌、除熱原後定容1000ml。在100級淨化條件灌入經除熱原的凍凍乾燥專用管制西林瓶中，半加塞裝入冷凍乾燥箱內，常規法冷凍乾燥，結束後箱內自動加塞，然後加鋁蓋，質量檢驗合格後為注射用複方蛇毒激凝酶。
根據上述複方製成外用噴霧劑舉例按處方量取複方生物組分，另加蛋白穩定劑水解明膠50ml、抗氧化劑焦亞硫酸鈉0.5g、滅菌純化水500l和適量的防腐劑，製成每包裝50ml的壓縮空氣作為動力的外用噴霧劑，用於創傷止血。
本發明的冷凍乾燥注射劑通過藥效學、急性毒性、一般藥理學、局部用藥毒性研究說明本發明的有益效果。實驗所用藥物為按照本發明實例的方法製備的製劑，稱為注射用複方蛇毒激凝酶。陽性對照品為立止血(瑞士SOLCO公司出品)。陰性對照組為生理鹽水。
1.複方蛇毒激凝酶主要藥效學試驗注射用複方蛇毒激凝酶每支含1凝血單位，靜脈給藥，劑量為0.003IU/kg，0.01IU/kg、0.03IU/kg，研究其給藥前後兔血漿凝血酶原時間、優球蛋白溶解時間、大鼠血漿中血栓素B2影響，結果表明，0.003IU/kg組在給藥後1小時、0.1IU/kg組給藥後20分鐘至3小時血漿凝血酶原時間明顯縮短(P＜0.05)，與給藥前比較，0.003IU/kg、0.03IU/kg組在給藥後3小時血漿凝血酶原時間明顯縮短(P＜0.01)。提示本品通過縮短血漿凝血酶原時間而起到促凝血作用。0.003IU/kg組在給藥後3小時、0.01IU/kg組在給藥後1小時及給藥後3小時、0.03IU/kg在給藥後20分鐘及給藥後3小時的優球蛋白溶解時間較對照組明顯延長(P＜0.05、P＜0.01)。與給藥前比較，0.03IU/kg組給藥後15分鐘和給藥後3小時各劑量組的優球蛋白溶解時間明顯延長(P＜0.05、P＜0.01)。提示本品有抑制纖維蛋白溶解的作用，從而達到止血的作用。0.01IU/kg組大鼠靜脈注射給藥1小時後，血中TXB2含量均較對照組增高(P＜0.05)。與給藥前比較0.003IU/kg、0.01IU/kg、0.03IU/kg各劑量組在靜脈注射給藥1小時後血中TXB2含量明顯增高(P＜0.05)。提本品可以提高血小板功能，促進血小板釋放TXB2，誘導血小板聚集從而發揮止血的作用。
2.複方蛇毒激凝酶急性毒性試驗注射用複方蛇毒激凝酶對小鼠一次性靜脈給藥和肌肉注射給藥的最大劑量均為80IU/kg。故本品小鼠靜脈注射給藥的LD50＞80 IU/kg，小鼠肌肉注射給藥的LD50＞80 IU/kg，約為臨床成人擬日用劑量的10倍，證明本品的安全性。
3.複方蛇毒激凝酶一般藥理學試驗以0.03IU/kg、0.1IU/kg、0.3IU/kg劑量分別一次性注射小鼠和貓，觀察其對小鼠神經系統及麻醉貓心血管和呼吸系統的影響。實驗結果表明，注射用複方蛇毒激凝酶可明顯減少乙酸誘發的小鼠扭體反應次數，顯示了明顯的陣痛作用，對小鼠的一般行為和自主活動無明顯影響。本品的三個劑量對麻醉貓心血管系統和呼吸系統未見明顯的影響。此次實驗的最高劑量為人擬臨床用量的18倍，表明本品在人用劑量下使用是安全可靠的以下通過實例進一步說明本發明實例處方類凝血酶50IU 類凝血激酶1000IU甘露醇30g 白蛋白0.2g注射用水1000ml分裝至管制西林瓶瓶中，冷凍乾燥1000支注射劑。
製備工藝分別取處方量的類凝血酶和類凝血激酶，加新鮮冷至20～30℃注射用水混合配成濃溶液，然後將處方量的輔料用注射用水溶解，將上述兩溶液混合均勻定容1000ml，調節pH至6.0～7.0，在100級淨化條件下用截留10000分子量平板切向流超濾器除菌、除熱原，濾液灌入經除菌除熱原降到室溫的管制西林瓶中，每瓶1ml含1凝血單位，半加塞裝入冷凍乾燥箱內，在-35℃預凍2小時，抽真空達10-1-10-3mmHg下逐步升溫升華乾燥，使擱板溫度達-20℃水分祛除90％時加速升溫乾燥，使製品溫度和擱板溫度最終都達到30℃，溫度曲線和真空曲線重合時視為凍乾結束，殘餘水分小於1％。在凍幹箱內自動將膠塞壓緊，從凍幹箱取出加鋁蓋，為複方蛇毒激凝酶成品。
權利要求
1.一種具有促凝血作用的複方生物組分及其藥物製劑，其特徵在於由類凝血酶和類凝血激酶複方的具有促凝血和止血的多組份生化製劑，由以下配比的生化組份及輔料製成類凝血酶 0.005IIU-1IU 類凝血激酶 0.03IU-2IU甘氨酸 5mg-50mg甘露醇 10mg-50mg 白蛋白 0.1mg-1mg。
2.根據權利要求1所述的一種具有促凝血作用的複方生物組分及其藥物製劑，其特徵在於由以下配比的生化組份及輔料製成類凝血酶 0.05IU-0.1IU 類凝血激酶 0.3IU-1IU 甘露醇 30mg 甘氨酸20mg。
3.根據權利要求2所述的一種具有促凝血作用的複方生物組分及其藥物製劑，其特徵在於由以下配比的生化組份及輔料製成類凝血酶 0.05IU-0.1IU 類凝血激酶 0.3IU-1IU 甘露醇 30mg 白蛋白0.2mg。
4.根據權利要求1或2或3所述的一種具有促凝血作用的複方生物組分及其藥物製劑，其特徵在於生化組份及輔料製成各種劑型。
5.根據權利要求4所述的一種具有促凝血作用的複方生物組分及其藥物製劑，其特徵在於生化組份及輔料製成製劑是注射劑、噴霧劑、塗劑。
6.根據權利要求4所述的一種具有促凝血作用的複方生物組分及其藥物製劑，其特徵在於生化組份及輔料製成製劑是注射劑是冷凍乾燥製劑。
7.根據權利要求1所述的一種具有促凝血作用的複方生物組分及其藥物製劑製備方法，其特徵在於，包括以下步驟a.類凝血酶提取、分離、純化精製；b.類凝血激酶提取、分離、純化鑑定；c.將上述生化組份按一定比例複合具有協同促凝血和止血作用並與可接受的載體混合製成一定生化製劑；d.在GMP條件下，經泠凍乾燥成品。
8.根據權利要求8所述的一種具有促凝血作用的複方生物組分及其藥物製劑製備方法，其特徵在於，步驟a中的分離純化採用體積排阻色譜和離子交換層析技術。
9.根據權利要求8所述的一種具有促凝血作用的複方生物組分及其藥物製劑製備方法，其特徵在於，步驟c中的藥物可接受載體是白蛋白，甘氨酸和甘露醇。
全文摘要
本發明涉及一種具有促凝血作用的複方生物組分及其藥物製劑，它是一種具有治療作用的由蛇毒中分離提取的新的多組分生化藥品。特別是一種由類凝血酶和類凝血激酶等組成的生化製劑。該製劑中類凝血酶是指低劑量具有止血作用的降纖酶，類凝血激酶是指同時參與內外源凝血過程的凝血X因子激活劑，它可將血漿中X因子激活為Xa，繼而將凝血酶原轉變為凝血酶，最後達到兩組分協同止血的作用。既可外用，也可皮下注射、肌肉注射及靜脈注射等，適用範圍廣，防治各種病因引起的出血。
文檔編號A61K47/42GK1727002SQ20041002011
公開日2006年2月1日 申請日期2004年7月26日 優先權日2004年7月26日
發明者周長海 申請人:周長海