穀氨酸脫氫酶的一種提取方法
2023-04-22 22:19:16
專利名稱：穀氨酸脫氫酶的一種提取方法
技術領域：
本發明屬於生物技術領域，尤其涉及以動物肝臟為原料提取穀氨酸脫氫酶的一種方法。
背景技術：
穀氨酸脫氫酶(glutamate dehydrogenase)是一種催化使氨還原性地固定到 α-酮戊二酸上形成穀氨酸反應的酶。它廣泛分布於細菌、酵母、植物和哺乳動物組織中，其中動物肝臟內含量最高，該酶在氮素代謝中起著中心作用，對細胞內氨的固定或氫的轉運起著重要的生物學作用，催化反應如下所示，可將氨固定形成穀氨酸，氨基被用於許多其他胺基酸的合成中。目前，穀氨酸脫氫酶已應用到醫療診斷中，此外，穀氨酸脫氫酶是製備尿素氮試劑盒(速率法)的必需酶之一。
權利要求
1.穀氨酸脫氫酶的一種提取方法，其特徵在於以動物肝臟為原料提取獲得穀氨酸脫氫酶粗酶液，依次經酸沉澱、硫酸銨鹽析、磷酸鈣凝膠吸附、透析、柱層析及冷凍乾燥後獲得穀氨酸脫氫酶成品。
2.如權利要求1所述的穀氨酸脫氫酶的一種提取方法，其特徵在於動物肝臟包括豬、牛、羊、雞等畜禽。
3.如權利要求1所述的穀氨酸脫氫酶的一種提取方法，其特徵在於粗酶製備工藝為 稱取定量動物新鮮肝臟，在高速組織搗碎機中搗碎10分鐘QOOOrmp)，加入0. 05M, pH 7. 6 磷酸鹽緩衝液(內含0. 15M NaCl)，充分攪拌，置4°C冰箱中過夜抽提，SOOOrmp離心20分鐘，收集上清液獲得粗酶液，其中加入的磷酸緩衝液體積為動物肝臟的3 5倍。
4.如權利要求1所述的穀氨酸脫氫酶的一種提取方法，其特徵在於酸沉澱工藝為穀氨酸脫氫酶粗酶液用10%酸溶液調節pH，4°C放置1小時(期間緩慢攪拌數次)，8000rmp離心15分鐘，沉澱用0. IM pH值7. 6磷酸緩衝液溶解，其中10%的酸溶液可以為甲酸、乙酸、 鹽酸，PH值調節為4. 5 4. 8。
5.如權利要求1所述的穀氨酸脫氫酶的一種提取方法，其特徵在於硫酸銨鹽析工藝為第一次鹽析在室溫下將酸沉澱定量樣品慢慢加入固體(NH4)2SO4到飽和度，4°C 過夜，8000rmp離心10分鐘。第二次鹽析取(NH4)2SO4鹽析後的上清液定量，加固體(NH4)2SO4到48%飽和度， 4°C過夜，離心，沉澱溶解在pH 7.6的磷酸緩衝液中。第三次鹽析在48%硫酸銨飽和度鹽析沉澱溶解液中加(NH4) #04至49%飽和度，沉澱溶解在PH 7. 6磷酸鹽緩衝液中。
6.如權利要求1所述的穀氨酸脫氫酶的一種提取方法，其特徵在於磷酸鈣凝膠吸附工藝為取定量49 %硫酸銨鹽析沉澱溶解液按比例加Qi3 (PO4) 2凝膠，充分攪拌，4°C冰箱過夜，得上清液，其中硫酸銨鹽析液同磷酸鈣凝膠的比例為1 0.25 1 0.5(v/w)。1
7.如權利要求1所述的穀氨酸脫氫酶的一種提取方法，其特徵在於柱層析工藝為 磷酸鈣凝膠吸附溶液4°C透析後，濃縮上樣，用磷酸緩衝液(0.05mol/L，pH 7.6)進行洗脫， 流速18mL/h，每管收集3mL ；測定穀氨酸脫氫酶活性，收集活性較高的各管酶液，濃縮後冷凍乾燥，製備獲得穀氨酸脫氫酶產品，其中柱層析選用柱料為kphadex G-150或kphadex G-250
8.如權利要求1所述的穀氨酸脫氫酶的一種提取方法，其特徵在於製備獲得的穀氨酸脫氫酶產品的比酶活高於7900U/mg，酶活回收率高於17%。
全文摘要
本發明公開了一種穀氨酸脫氫酶的提取方法，屬於生物技術領域。該方法的主要步驟為動物肝臟原料預處理、粗酶製備、酸沉澱、硫酸銨鹽析、磷酸鈣凝膠吸附、透析、柱層析、冷凍乾燥獲得穀氨酸脫氫酶成品。本發明工藝成熟，操作簡單、安全，成本低，提取率高，產品回收率可達到17％以上，產品活性高，比酶活可達到7900U/mg以上，同時可實現資源的高效利用，減少廢液排放，有效降低環境汙染，適合於大規模生產。
文檔編號C12N9/06GK102409030SQ20111042283
公開日2012年4月11日 申請日期2011年12月16日 優先權日2011年12月16日
發明者高聚霞 申請人:西藏金稞集團有限責任公司