馬動脈炎病毒的液相晶片檢測引物及檢測方法

2023-04-23 07:41:36

專利名稱：馬動脈炎病毒的液相晶片檢測引物及檢測方法
技術領域：
本發明屬於動物病毒檢測技術領域，具體涉及一種馬動脈炎病毒的液相晶片檢測引物及檢測方法。
背景技術：
馬病毒性動脈炎(Equine Viral Ateritis，EVA)是一種由馬病動脈炎病毒 (Equine Ateritis Virus，EAV)引起，在馬屬動物之間通過呼吸道或生殖器官傳播的傳染病。馬匹感染EAV後大部分呈亞臨床感染，一部分成年馬的流感樣症狀、懷孕母馬發生流產，新生馬駒發生間質性肺炎。約有30% -60%種公馬感染EAV後持續帶毒，精液中的病毒可傳播給雌馬，引起EAV的傳播。該病在臨疹上表現為發熱、白細胞減少，常伴有眼瞼水腫和四肢浮腫，其特徵性病理變化為小動脈內膜變性和壞死。本病主要以美洲和歐洲為中心呈世界性分布，以小規模或中等規模的流行形式反覆發生。澳大利亞雖然沒有臨床症狀發生，但是通過對保存血清的檢查表明，1975年澳大利亞就有EAV抗體陽性馬。對1989-1992年收集的馬血清檢查結果表明，南非也有抗體陽性馬。1996年日本發現EAV抗體陽性的賽馬。1996年我國出口韓國的馬匹中也發現了 EAV 抗體陽性馬，但至今沒有從馬匹中分離到EAV。近年來，由於賽馬業的發展和國外對食用馬的需求，進出口馬病的檢測量不斷增加。國內外研究者開發了多項馬病快速檢測診斷方法，如山東檢驗檢疫局馬病實驗室研究的ELISA、PCR檢測馬鼻肺炎和馬動脈炎，固相基因晶片技術檢測五種馬病等這些方法基本上實現了快速檢測的需要。但是有些病還沒有成熟的檢測技術及試劑，如錐蟲病、焦蟲病等還需要用進口檢測試劑。進口試劑和試劑盒特別昂貴，且使用時必須提前2個月左右定貨， 會嚴重影響檢測進程。此外，現有的快速檢測方法中，ELISA、PCR等技術通量小，費時費力； 固相晶片技術可以實現高通量檢測，但成本特別昂貴，無法在馬病檢測中應用。迫切需要一種高通量、低成本、快速特異、靈敏可靠檢測方法。

發明內容
本發明的目的是提供馬動脈炎病毒的液相晶片檢測引物及檢測方法，即一種操作簡單、結果準確的馬動脈炎病毒液相晶片檢測方法，及其所用到的引物，從而彌補現有技術的不足。本發明為實現上述目的，採用液相晶片技術。該技術是在核酸水平上的一種檢測技術，具有準確性好、靈敏度高的特點。其原理是將編碼微球單個逐一通過檢測通道時受到雙色雷射(如紅色和綠色)同時照射，第一束雷射激發微球的分類螢光，根據螢光編碼確定微球的類別，即微球內部的兩種螢光物質受激發後可發射兩種不同波長的螢光，不同類別微球內這兩種螢光物質比例不同，則螢光強度比例也不同，從而將不同的特異性反應區分開來；第二束雷射激發報告分子上的螢光素，根據螢光強度確定微球上結合的報告分子的數量從而確定目標分子的數量(定量)。系統只記錄與紅色螢光同時出現的綠色螢光信號，
3不記錄未結合的報告分子螢光信號，因此檢測前無需洗脫未結合的報告分子。此外，利用流式細胞術中90°C角散射光可有效地消除微球聚集對結果造成的影響。各種螢光信號經分析軟體進行數位化處理，可獲得檢測物的種類和數量。本發明中所涉及到的引物和探針序列如下正向引物dirct primer :5-CAACGGGTACACCGCAGTTGGT-3~ SEQ ID NO :1反向引物reverse pr imer :5-CGGACCCGCATCTGACCAAACA_3~ SEQ ID NO :2探針Probe :5~-CGGCGGCGACAGCCTACA-3~ SEQ ID NO :3。正向引物和反向引物5』端進行生物素標記；探針的5』端進行氨基化修飾。本發明的引物和探針用於檢測馬動脈炎病毒，其檢測方法包括有1)檢測樣品 RNA的提取、2) RT-PCR擴增目的片段、3)寡核苷酸探針與微球共價偶聯、4)探針與RT-PCR 擴增片段雜交和幻液相晶片儀分析步驟。其中步驟^RT-PCR反應的循環條件為第一階段，反轉錄50°C :30min ；第二階段，預變性94°C :3min ；第三階段，擴增94°C :30s, 59°C :30s, 72°C :30s，30 個循環；第四階段，延伸72°C :5min。本發明的檢測方法能夠對樣品進行快速檢測，從樣品處理到出結果僅需4小時左右；由於採用了接近生物反應體系的液相晶片系統和特異性的探針，使該方法可與螢光定量PCR相媲美。本發明設計的引物與常見馬屬動物其他病毒不發生交叉反應，由於採用了液相反應體系，使該方法的特異性高於傳統檢測方法，大大杜絕了非特異性擴增造成的假陰性結果。本發明的方法提供了優化的操作程序，操作簡單，具有良好重複性。
具體實施例方式下面結合具體實施例對本發明的方法進行詳細描述。本發明所用到的儀器耗材信息如下表面羧基化的螢光編碼微球、鞘液購置於BD 公司，TMAC temtrameihyl-ammdnium chloride、Tris、SD S(10% sol μ tion)購置於美國 Sigma 公司，SPAE Str印tavidin-R-phycoerythrin 購於美國 Prozyme 公司，RNA 提取試劑盒、RT-PCR試劑盒購於大連寶生物公司。主要設備包括BD FACSArray液相晶片儀、梯度 PCR擴增儀、凝膠成像系統、Sigma高速冷凍離心機等。通過hternet登陸美國國立生物信息技術中心(NCBI)，查詢檢索已公布的馬動脈炎病毒基因序列。利用I^rimer Premierf.O軟體設計引物和探針，並最終篩選出一對具有高特異性的引物和探針，參見表1。表1設計的引物和預期目的片段大小
引物和探針序列ι增片段大小Primerl5』-biotm-CAACGGGTACACCGCAGTTGGT-3、145bpPrimer25』-biotin-CGGACCCGCATCTGACCAAACA-3』ProbeNH2-CGGCGGCGAC AGCCT AC A-3、
注5』 -Biotin表示5』端進行生物素標記；5、-NH2表示5』端進行氨基化修飾。本發明的檢測方法如下1、檢測樣品RNA的提取採用大連寶生物公司的RNA提取試劑盒提取樣品RNA，按照說明書的步驟進行操作，提取的樣品電泳檢測提取質量。2、RT-PCR擴增目的片段採用RNA提取試劑盒(大連寶生物公司)進行EAV RNA的提取。在0. 2mLPCR反應管中，依次加入 10 X RT-PCR by ffer，2. 5μ L、、dNTP (各 2. 5mmol/L)，2· 0 μ L、IOpmol/μ L 引物對，各 1 μ L、Inhibiter 0· 5 μ L、AMV XL 0· 5 μ L、AMV Taq (5M/μ L)，0· 25μ L、25mmol/ L MgCl2, 5. 0 μ L、RNA模板5. 0 μ L，加入雙蒸水7. 25 μ L使反應體積達到25 μ L。在PCR儀 (Eppendorf Mastercycler Gradient)上進行 RT-PCR 擴增。優化並確定 RT-PCR 工作程序 500C 30min ；94°C 2min ；然後 94°C 30sec、59°C 30sec、72°C 30sec,30 個循環；最後 72°C延伸5min，4°C保溫。擴增產物用2%瓊脂糖凝膠電泳，在紫外凝膠圖像分析系統(Alphamager 2200) 上觀察、分析擴增產物。3、寡核苷酸探針與微球共價偶聯1)將微球漩渦混合20s充分分散；取3 X IO6個微球(75 μ 1)，於1. 5ml離心管中 IOOOOg離心lmin，去上清；2)加入50 μ 1 0. lmol/L甲基咪唑溶液(ph4. 5)，漩渦混合，超聲波處理 (30s_imin)；3)加入氨基化探針1. Onmol,漩渦混合；4)加入2. 5 μ L碳二亞胺溶液(IOmg的碳二亞胺粉末加入1. OmL的滅菌純水，現用現配)充分混勻，室溫避光孵育30min。5)重複 4) 一次。6)加入 1. Oml 0. 02% Tween-20，混勻，IOOOOg 離心 lmin，棄上清；7)加入 1. Oml 0. 1% SDS，混勻，IOOOOg 離心 lmin，棄上清；8) 0. lmol/L甲基咪唑溶液(ph4. 5) 100 μ L重懸微球，2_8°C避光保存待用。4、探針與RT-PCR擴增片段雜交雜交體系包換1.5yL探針偶聯微球，33yL 1. 5 X TMAC雜交液，14. 5 μ LTE， 2. 5yL RT-PCR產物。混合均勻後於98°C變性lOmin，在選定溫度下孵育15min，18000g離心aiiin去上清；加入50μ L用IXTMAC雜交液稀釋的PE標記的鏈親合素(1 500)，選定溫度下孵育lOmin，18000g離心^iin去上清；加入50 μ L IX TMAC雜交液，漩渦混合使微球重懸，上BD FACSArray液相晶片儀對雜交後的微球進行分析。雜交溫度的優化，雜交反應時間在15min條件下，根據探針的Tm值，選48°C、50°C、 52°C、54°C、56°C等5個溫度梯度為研究對象，考察不同雜交溫度下液相晶片的檢測效果。5、液相晶片儀分析步驟利用BD FACSArray液相晶片儀對雜交微球進行分析，參與計數的螢光編碼微球均 ^ 100個，表明用於計數的螢光編碼微球數量有效，所產生的MFI值可信，各個螢光編碼微球的空白對照MFI均< 500，表明結果有效，試驗可以進行結果判定。
液相晶片定性比值結果(LQRR)等於樣品校正後的MFI值(MFIS)與空白對照 MFI平均值(MFIB)的比值，即LQRR = MFIS/MFIB。如果LQRR彡3，判定為陽性樣本；如果 2彡LQRR < 3，則判定為可疑；如果LQRR < 2，則判定為陰性。實施例1本發明的馬動脈炎病毒液相晶片引物探針和檢測方法的特異性分析1、材料為馬動脈炎病毒(EAV)、馬鼻肺炎病毒(EHV)、馬流感病毒H3N8亞型、馬流感病毒H7N7亞型和馬焦蟲；其中馬動脈炎病毒作為陽性檢測樣品。2、馬動脈炎病毒液相晶片檢測方法的特異性試驗利用本研究建立的液相晶片檢測馬動脈炎病毒的方法，提取馬動脈炎病毒、馬鼻肺炎病毒、馬流感病毒H3N8亞型、馬流感病毒H7N7亞型和馬焦蟲等的RNA或DNA，並進行擴增。將RT-PCR產物或PCR產物，用液相晶片檢測體系進行檢測。判斷整個液相晶片檢測體系對非目標物有無檢測信號。3、結果分別以馬動脈炎病毒(EAV)、馬鼻肺炎病毒(EHV)、馬流感病毒H3N8亞型(H3N8)、 馬流感病毒H7N7亞型(H7N7)和馬焦蟲等的RT-PCR產物或PCR產物模板，進行液相晶片檢測。結果(見表2)表明，對陽性樣品馬動脈炎病毒EAV的檢測結果為陽性，而對非目標物擴增產物的檢測值均為陰性，表明本發明的引物和探針在檢測的時候不會產生假陽性或假陰性。表2液相晶片檢測體系特異性驗證
權利要求
1.一種馬動脈炎病毒的液相晶片檢測的引物和探針，其特徵在於，引物和探針的核酸序列如下正向引物=SEQ ID NO 1 反向引物Γ SEQ ID NO 2 探針 Γ SEQ ID NO :3ο
2.如權利要求1所述的引物和探針，其特徵在於所述的正向引物和反向引物5』端進行生物素標記；探針的5』端進行氨基化修飾。
3.一種液相晶片檢測馬動脈炎病毒的方法，其特徵在於，是用權利要求2所述的引物和探針進行檢測。
4.如權利要求3所述的方法，其特徵在於包括有1)檢測樣品RNA的提取、2)RT-PCR擴增目的片段、幻寡核苷酸探針與微球共價偶聯、4)探針與RT-PCR擴增片段雜交和幻液相晶片儀分析步驟。
5.如權利要求4所述的方法，其特徵在於所述的步驟2)RT-PCR反應的循環條件為 第一階段，反轉錄50°C :30min ；第二階段，預變性94°C :3min ；第三階段，擴增 94°C :30s, 59°C :30s，72°C :30s，30 個循環； 第四階段，延伸720C :5min0
全文摘要
本發明涉及一種馬動脈炎病毒的液相晶片檢測引物及檢測方法，本發明的檢測方法能夠對樣品進行快速檢測，從樣品處理到出結果僅需4小時左右；由於採用了接近生物反應體系的液相晶片系統和特異性的探針，使該方法可與螢光定量PCR相媲美。本發明設計的引物與常見馬屬動物其他病毒不發生交叉反應，由於採用了液相反應體系，使該方法的特異性高於傳統檢測方法，大大杜絕了非特異性擴增造成的假陰性結果。本發明的方法提供了優化的操作程序，操作簡單，具有良好重複性。
文檔編號C12N15/11GK102424865SQ20111042698
公開日2012年4月25日 申請日期2011年12月19日 優先權日2011年12月19日
發明者嶽志芹, 徐彪, 朱來華, 梁成珠, 王群, 肖西志, 趙玉然, 鄧明俊, 鄭小龍 申請人:山東出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心