Cbfα1基因敲除劑的製作方法
2023-04-23 00:58:16
專利名稱：Cbfα1基因敲除劑的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種核心結合因子(core binding factor alpha 1，cbf α 1)基因的 敲除劑,尤其涉及一種針對cbf α 1基因的DNA序列GACTGTACGGGGTCGCCAGCCGCC的基因敲 除劑。
背景技術：
cbf α 1基因表達一種核心轉錄因子，該轉錄因子通過調節生長因子和骨特異性細 胞外基質蛋白的表達，進一步參與成骨細胞的分化和骨的發育過程。其表達異常可阻礙膜 內成骨和軟骨內成骨，影響胚胎期、胎兒期和出生後骨組織的生長。cbfa 1基因的突變可 以導致鎖骨顱骨發育異常。Cbfal基因在人類、小鼠、斑馬魚等動物中都有同源基因。研 究cbf α 1基因的功能和信號通路對於研究成骨細胞和破骨細胞的發育以及設計骨相關疾 病治療方案有重要意義。目前研究基因的功能和信號通路主要是通過反向遺傳學技術，所述反向遺傳學技 術主要有傳統的基因打靶技術，Tilling技術，RNAi，過表達技術等。傳統的基因敲除技術 已經有20多年的歷史，在小鼠中建立了很成熟的技術體系，可以定點敲除基因，但是該技 術應用於不同的物種中，需要建立不同物種的胚胎幹細胞系，操作複雜，另外由於斑馬魚、 果蠅等非哺乳動物很難建立胚胎幹細胞系，難於實施該技術。Tilling技術是一種可以使基 因產生突變的技術，但是該技術費時、費力、而且很難在定點位置進行突變。RNAi技術是一 種常見的降低或阻滯基因表達的技術，但是該技術存在以下兩個缺點一是作用的時間很 短，RNA降解較快；二是產生的表型不能遺傳。過表達技術也只是針對某個基因，在翻譯水 平改變基因的表達水平，不能得到目的基因缺失的突變體。鑑於此，研發簡便實用的基因敲除劑，快速定點敲除cbfa 1基因具有重大的應用 價值。
發明內容
針對現有技術的不足，本發明要解決的問題是提供一種cbfa 1基因敲除劑，即針 對cbf α 1基因的DNA序列GACTGTACGGGGTCGCCAGCCGCC的基因敲除劑。所述cbf α 1基因 敲除劑操作簡便實用，可以在GACTGTACGGGGTCGCCAGCCGCC位點快速定點敲除cbf α 1基因。本發明所述的cbf α 1基因敲除劑，包括兩種鋅指核酸酶(Zinc finger nuclease, ZFN)；其特徵在於所述鋅指核酸酶是鋅指核酸酶ZFNA和鋅指核酸酶ZFNB ；其中，鋅指核 酸酶ZFNA的胺基酸序列如SEQ ID No. 1所示，鋅指核酸酶ZFNB的胺基酸序列如SEQ ID No. 2所示。上述鋅指核酸酶ZFNA包括鋅指結構ZFa、Nc0 I酶切位點(CCATGG)和非特異性切 割結構域Fok I-RV，其中ZFa的胺基酸序列如SEQ ID No. 3所示，ZFa特異性結合序列為 CCAGCCGCC。上述鋅指核酸酶ZFNB包括鋅指結構ZFb、Nco I酶切位點(CCATGG)和非特異性切割結構域Fok I-DA，其中ZFb的胺基酸序列如SEQ ID No. 4所示，ZFb特異性識別序列 GACTGTACG 的互補序列為 CGTACAGTC。ZFNA和ZFNB結構大致相同，都包括鋅指結構(Zinc finger, ZF)和一個非特異性 切割結構域，ZFNA的切割結構域Fok I-RV與ZFNB的切割結構域Fok I-DA結合成異元二 聚體特異作用於兩端識別序列之間的6個鹼基GGGTCG，切割出粘性末端，在生物體的修復 過程中，通過非同源末端連接修復的方式在這個位點產生永久性突變。本發明所述的Cbfa 1基因敲除劑的製備主要包含以下三個步驟[1]通過兩步法PCR合成鋅指核酸酶ZFNA和ZFNB的鋅指結構ZFa和ZFb ；[2]構建兩個表達質粒，分別包含鋅指核酸酶ZFNA和ZFNB的核酸序列；[3]體外表達鋅指核酸酶ZFNA和ZFNB，並純化這兩種蛋白。本發明所述的cbfa 1基因敲除劑在各種生物的cbfa 1基因定點敲除中的應用本發明所述的cbf α 1基因敲除劑可應用於對斑馬魚、小鼠、鳥類等的cbf α 1基因 進行定點敲除，進而可深入研究cbf α 1基因的功能和相關的信號通路。本發明所述的cbfa 1基因敲除劑具備的優勢是(1)應用範圍廣，可以在體外培養的細胞、胚胎細胞、個體水平進行。(2)基因敲除的位點特異性強，針對小鼠cbf α 1基因的mRNA序列的第795 個-818個鹼基對(GACTGTACGGGGTCGCCAGCCGCC)，也可以針對人類細胞系的進化保守位點 TTTGACTCTTATCAAAGACCTGAT。(3)操作過程簡單，僅需要一名技術人員。(4)操作過程所需時間短，理論完成周期僅為2個月。
圖Icbf α 1基因敲除劑的鋅指結構核酸序列合成的結果。圖中數字表示泳道，第1 泳道是 DNA marker,自上到下條帶依次為 2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp。第 2、3 泳 道為鋅指結構ZFa，第4、5泳道為鋅指結構ZFb。本圖說明通過兩步法合成的兩段鋅指結構 序列的大小是正確的。圖2cbf α 1基因敲除劑的鋅指結構ZFa的測序結果。第一個序列為測序結果，第 二個序列為設計的鋅指序列。根據測序結果比對，通過兩步法合成的鋅指結構ZFa序列是 準確的。圖3cbf α 1基因敲除劑的鋅指結構ZFb的測序結果。第一個序列為測序結果，第 二個序列為設計的鋅指序列。根據測序結果比對，通過兩步法合成的鋅指結構ZFb序列是 準確的。圖4cbf α 1基因敲除劑的切割結構域Fok I序列的擴增。圖中數字表示泳道，第1 泳道為 DNA marker,自上到下條帶依次為 2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、lOObp。第 2泳道是FOK I-DA的擴增結果，第3泳道是FOK I-RV的擴增結果。圖5cbf α 1基因敲除劑的鋅指核酸酶ZFNA和ZFNB蛋白的表達純化檢測。圖中數 字表示泳道,第1泳道為Protein marker自上到下依次為80KD、60KD、30KD、20KD。第2泳道 為純化後的ZFNA蛋白，第3泳道為純化後的ZFNB蛋白。本圖說明含有質粒PET-ZFNA_30a 的大腸桿菌菌株和含有質粒PET-ZFNB-30a的大腸桿菌菌株，誘導後的上清蛋白純化後，目的蛋白約在30KD處，純化的結果可以用於進一步的實驗。圖6cbf α 1基因敲除劑的體外檢測結果。圖中數字表示泳道，第1泳道是DNA marker,自上到下依次為 15000bp、10000bp、7500bp、5000bp、3000bp、1500bp、lOOObp、 500bp。第2泳道是對照組，第3泳道是酶和底物比例為2 1的體外檢測結果，第4泳道 是酶和底物比例為1 1的體外檢測結果。經過瓊脂糖電泳的分析表明，在鋅指核酸酶和 底物的反應比例為1 1的時候是反應的最佳比例。在這種反應比例下，鋅指核酸酶的效 果是最好的，幾乎把底物質粒的所有超螺旋結構都切開了。
具體實施例方式下面結合實施例對本發明進一步說明實施例1cbfa 1基因敲除劑的合成方法主要分為以下幾步[1]利用美國國立生物信息中心(National center for Biotechnology Information, NCB I)的Nucleotide資料庫搜索得到cbfa 1的DNA序列、mRNA序列以及 cbfa 1的進化保守位點，向zinc finger tools網站中輸入cbfa 1的mRNA序列，在搜索到 的所有位點中根據保守結構域Runt分布區域得到靶位點GACTGTACGGGGTCGCCAGCCGCC ；[2]根據zinc finger tools網站中得到的靶位點，得到該靶位點相應的特異鋅指 結構的胺基酸序列，ZFa的具體胺基酸序列見SEQ ID No. 3，ZFb的具體胺基酸序列見SEQ ID No. 4 ；[3]根據斑馬魚的密碼子偏愛性得到相應的鋅指結構的核酸序列，ZFa的核酸序 列見SEQID No. 5，ZFb的核酸序列見SEQ ID No. 6 ；[4]兩步法合成鋅指結構的核酸序列，將所得到的鋅指結構胺基酸序列輸入網站 DNAfforks中，將參數調好，得到輸出的引物序列，經過兩步法PCR得到目的基因，瓊脂糖電 泳檢測如圖1，得到的ZFa的鋅指序列的測序結果如圖2，ZFb序列的測序結果如圖3 ；[5]分別從質粒 PCMV-FOK I-RV 和質粒 PCMV-F0K I-DA (購自 Fermentas 公司)中 經過PCR擴增Fok I-RV和Fok I-DA的序列並各自加上NcoI和Xho I兩個酶切位點，具體 檢測結果見圖4;[6]將ZFa與Fok I-RV通過酶切連入表達載體PET_30a (購自Fermentas公司) 中，構建表達載體PET-ZFNA-30a ；[7]將ZFb與Fok I-DA通過酶切連入表達載體PET_30a (購自Fermentas公司) 中，構建表達載體PET-ZFNB-30a ；[8]將構建好的質粒PET-ZFNA_30a和PET_ZFNB_30a轉入表達菌株中，在22°C和 0. 3mMIPTG (異丙基-β -D-硫代吡喃半乳糖苷)的誘導下，經過超聲破碎後，將上清蛋白在 4°C過鎳柱純化蛋白，並用SDS (聚丙烯醯胺凝膠電泳)檢測誘導前後純化後的蛋白樣品，具 體結果見圖5 ；[9]將純化的鋅指核酸酶ZFNA和ZFNB按照1 1的比例混合，得到cbf α 1基因 敲除劑。實施例2cbf α 1基因敲除劑切割效率的體外檢測
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[1]按照實施例1的方法，得到cbfa 1基因敲除劑；[2]通過PCR擴增出靶位點序列GACTGTACGGGGTCGCCAGCCGCC，將靶位點連入 PEASY-Blunt質粒(購自於北京全式金生物公司)中，構建出PEASY-targetl-Blunt作為反 應底物；[3]將cbf α 1基因敲除劑和底物按照1 1的比例加入體外反應體系中，在25°C 下反應2小時，利用瓊脂糖電泳檢測體外反應結果，見圖6。實施例3cbf α 1基因敲除劑的切割效率在斑馬魚個體水平的檢測[1]按照實施例1的方法，得到cbfa 1基因敲除劑，加入適量甘油，構成鋅指核酸 酶混合物；[2]將鋅指核酸酶混合物通過顯微注射的方法，注射到斑馬魚單細胞胚胎中，每顆 卵注射2pmol ；[3]將注射胚胎養成成魚；[4]提取成魚的基因組DNA，對cbf α 1基因靶位點處進行PCR檢測；[5]cbf α 1基因敲除的成魚之間自交產生子代，觀察子代表型，提取子代基因組 DNA，檢測cbfa 1基因突變情況。實施例4cbf a 1基因敲除劑的核酸序列在斑馬魚中的應用[1]按照實施例1的方法中的前7步，得到表達載體PET-ZFNA_30a和 PET-ZFNB-30a,從質粒上擴增ZFNA和ZFNB，通過PCR的方法在ZFNA和ZFNB的5』端加上斑 馬魚特有的核定位信號，構建出NLS-ZFNA和NLS-ZFNB序列；[2]將NLS-ZFNA和NLS-ZFNB全序列酶切連接到質粒PEGFP-附(購自於Fermentas 公司)中，構建出注射質粒 PEGFP-NLS-ZFNA-N1 和 PEGFP-NLS-ZFNB-N1 ；[3]將注射質粒 PEGFP-NLS-ZFNA-N1 和 PEGFP-NLS-ZFNB-N1 分別線性化，按照 11的比例混合這兩種質粒；[4]將混合質粒通過顯微注射的方法注射到斑馬魚單細胞胚胎中，每個胚胎注射 2nl混合質粒；[5]用螢光顯微鏡記錄注射後的胚胎的發育狀況，並將注射胚胎養成成魚；[6]提取成魚的基因組DNA，對cbf α 1基因靶位點處進行PCR檢測；[7]cbf α 1基因敲除的成魚之間自交產生子代，觀察子代表型，提取子代基因組 DNA，檢測cbfa 1基因突變情況。實施例5cbfa 1基因敲除劑在小鼠中的應用[1]按照實施例1的方法，得到cbfa 1基因敲除劑，加入適量甘油，構成鋅指核酸 酶混合物；[2]將鋅指核酸酶混合物隨精子注射到小鼠的卵細胞中；[3]將注射後的小鼠受精卵培養到8細胞期，轉入假孕小鼠中；[4]將子一代小鼠飼養到成鼠階段，取鼠尾組織提取基因組DNA，檢測cbf a 1基因 靶位點的突變情況；
[5] cbf α 1基因敲除的子一代小鼠之間自交產生子二代，觀察子二代表型，提取子 二代基因組DNA，檢測Cbfa 1基因突變情況。
權利要求
一種cbfα1基因敲除劑，包括兩種鋅指核酸酶；其特徵在於所述鋅指核酸酶是鋅指核酸酶ZFNA和鋅指核酸酶ZFNB；其中，鋅指核酸酶ZFNA的胺基酸序列如SEQ ID No.1所示，鋅指核酸酶ZFNB的胺基酸序列如SEQ ID No.2所示。
2.如權利要求1所述的cbfa1基因敲除劑，其特徵在於所述鋅指核酸酶ZFNA包括 鋅指結構ZFa、Nco I酶切位點和非特異性切割結構域Fok I-RV，其中ZFa的胺基酸序列如 SEQID No. 3所示，ZFa特異性結合序列為CCAGCCGCC。
3.如權利要求1所述的cbfa1基因敲除劑，其特徵在於所述鋅指核酸酶ZFNB包括 鋅指結構ZFb、Nco I酶切位點和非特異性切割結構域Fok I-DA，其中ZFb的胺基酸序列如 SEQID No. 4所示，ZFb特異性識別序列GACTGTACG的互補序列為CGTACAGTC。
全文摘要
本發明公開了一種cbfα1基因敲除劑，包括鋅指核酸酶ZFNA和鋅指核酸酶ZFNB；其中，鋅指核酸酶ZFNA的胺基酸序列如SEQ ID No.1所示，鋅指核酸酶ZFNB的胺基酸序列如SEQID No.2所示。本發明所述的cbfα1基因敲除劑可以快速、簡單、特異的敲除cbfα1基因，主要應用於對斑馬魚、小鼠、鳥類等動物的cbfα1基因進行敲除，從而進一步研究不同物種cbfα1基因的功能和相關的信號通路。
文檔編號C12N9/22GK101979523SQ20101050315
公開日2011年2月23日 申請日期2010年10月12日 優先權日2010年10月12日
發明者劉洪卯, 時永香, 王雯雯, 羅在禮 申請人:山東大學