利用EcoRII酶切圖譜庫檢測細菌整合子中基因盒陣列的方法

2023-04-25 00:25:46

專利名稱：利用EcoRII酶切圖譜庫檢測細菌整合子中基因盒陣列的方法
技術領域：
本發明屬於分子生物學技術及耐藥細菌監測領域。具體地說，本發明涉及一種利用限制性內切酶Ec0RII對細菌整合子中基因盒陣列PCR擴增產物進行酶切構建酶切圖譜庫，通過Ec0RII酶切圖譜庫實現快速檢測細菌整合子中基因盒陣列的方法。
背景技術：
醫療水平的進步，種類繁多的抗生素日益被開發出來並投放市場。大量應用於臨床及獸醫方面，甚至在畜牧業中，也常使用其促進生長，正是這些抗生素的廣泛應用，尤其是不合理地使用，造成細菌的耐藥以至多重耐藥問題日益嚴重，耐藥機制日趨複雜。其中， 細菌主要的耐用機制有細菌可以通過產生滅活酶或鈍化酶，破壞或修飾抗菌藥物的活性結構或者降低與作用靶位點結合的能力而使抗菌藥物失去效用；膜耐藥，通過膜基因的改變而影響膜的通透性；細菌中編碼靶位基因的突變導致靶位結構發生改變，使得抗菌藥物不能正常識別作用靶位點並與之結合或結合力下降，藥物失去抑殺作用；泵的機制，形成一個對抗生素的外排系統。隨著對細菌耐藥機制研究的深入，1989年，Stokes等通過比對Tn21的aadA 和R46的oxa2、aadA兩側的序列並結合以前做的大量類似實驗的限制性酶切圖譜，初步確定了 3'保守末端和5'保守末端的範圍(Stokes H W，Hall R Μ. A novel family of potentially mobile DNA elements encoding site-specific gene-integration functions :integrons. [J]. Mol Microbiol. 1989,3(12) :1669-1683) 由於保守末端的外緣不具有反向末端重複序列、正向末端重複序列或靶位點重複序列等轉座子所具有的結構特點，首次提出了一種新型的基因元件——整合子。1991年，Hall通過分析轉座子 Tn7上各種不同的耐藥基因，正式提出了整合子-基因盒系統的概念(Hall R Μ, Brookes D Ε, Stokes H W. Site-specific insertion of genes into integrons :role of the 59-base element and determination of the recombination cross-over point. [J] .Mol Microbiol. 1991,5(8) :1941-1959)。整合子(integron)是一個能通過自身編碼的整合酶識別、捕獲、整合或剪切細胞外游離基因或基因片段，並使之轉化為功能性基因的重組表達系統(Rowe-magnus D A, Mazel D.Integrons matural tools for bacterial genome evolution. [J]. Curr Opin Microbiol. 2001,4(5) :565-569 ；Mazel D.Integrons :agents of bacterial evolution. [J]. Nat Rev Microbiol. 2006,4(8) :608-620)。被其捕獲和整合的細胞外游離基因或基因片段多為編碼耐藥性蛋白如β-內醯胺酶(β-lactamase)、氨基糖苷類鈍化酶、林可黴素類鈍化酶、氯黴素乙醯轉移酶、大環內酯類鈍化酶、氨基糖甙乙醯轉移酶(AAC)、氨基糖甙磷酸轉移酶(ANT)核苷轉移酶(APH)等的耐藥基因。通常整合子根據整合酶(integrase)基因序列的不同進行分類，目前比較公認的是分為五類(Partridge S R，Tsafnat G，Coiera Ε, et al. Gene cassettes and cassette arrays in mobile resistance integrons. [J]·FEMS Microbiol Rev. 2009)與由Tn402衍生的功能性和非功能性轉座子有關的1型整合子，這類整合子通常插入到轉座子(如Τη21)內，現已報導的類型較多；與衍生的Τη7有關 2型整合子；3型整合子報導較少，其通常位於特徵尚不明確的各類質粒上；4型和5型整合子通常與弧菌的甲氧苄啶耐藥性相關，4型整合子是霍亂弧菌SXT元件的構成部分，5型整合子位於沙門氏弧菌質粒上的複合轉座子內。一般情況下，提到的整合子主要指1型整合子antll)、2型整合子antI2)、3型整合子(IntI3)。由於1型整合子中所含有的基因盒陣列最為豐富，故其攜帶多樣的基因盒陣列通過水平基因轉移(horizontal gene transfer, HGT)造成細菌耐藥問題也最為突出。1型整合子的典型結構通常包括5 『保守末端(5 『 -conserved segment, 5' -CS)、3'保守末端(3' -conserved segment，3'-⑶)以及夾在兩保守末端之間的可變區(variable region)。在可變區，通常整合有一個或數個基因盒。這些基因盒由於種類、 數量及排列順序不同可以形成多樣的基因盒陣列，故根據1型整合子的結構特點在保守區設計引物可以將可變區中的基因盒陣列擴增出來。整合子廣泛分布於各類細菌中尤其是革蘭氏陰性細菌。它是細菌的固有結構，在抗菌藥物發現和使用以前即已存在，並非由抗生素的濫用引起，但是抗生素的廣泛使用使得整合子這種功能性基因的重組表達系統在選擇壓力下，為了適應環境變得活躍起來。它本身雖然無法移動，但其通常由接合型質粒(plasmid)、轉座子(transposon)、整合型噬菌體(kicteriophage)等可移動性元件攜帶，通過接合、轉化及轉導等方式進行水平基因轉移(HGT)，造成細菌的耐藥問題日益嚴重。急需尋找一種既準確又簡便快捷的方法來研究整合子所捕獲的各種耐藥基因盒。這樣就可以實現有效地監測整合子中耐藥基因盒的水平轉移，快速方便地確定在最近一段時間內耐藥細菌中哪類耐藥基因盒出現的頻率較高，故可通過減少某些抗菌藥物的使用，降低該類耐藥基因盒水平轉移的選擇壓力，防止耐藥細菌的爆發性流行。當前研究中，檢測整合子中所含有的基因盒陣列主要通過PCR擴增，直接對擴增產物進行測序再比對測序結果等方法完成。此方法雖結果準確但實驗過程耗時長，實驗費用高。然而，經檢索國內外還沒有利用Ec0RII酶切圖譜庫檢測細菌整合子中基因盒陣列的研究報導。

發明內容
針對當前研究中常用方法耗時長、費用高的不足，本發明目的是提供一種利用限制性內切酶Ec0RII對細菌整合子中基因盒陣列PCR擴增產物進行酶切構建酶切圖譜庫，通過Ec0RII酶切圖譜庫實現快速檢測細菌整合子中基因盒陣列的方法。本發明所述利用Ec0RII酶切圖譜庫檢測細菌整合子中基因盒陣列的方法是1.取醫院周圍的廢水樣品，以0. 22 μ m孔徑無菌濾膜過濾富集菌體，將膜轉接到 LB液體培養基中過夜培養，梯度稀釋菌液塗布於含有IOOmgr1氨苄西林(AMP) JOmgr1卡那黴素(KAN)，SOmgF1 四環素(TET)，SOmgF1 頭孢他啶(CAZ)，IOmgF1 鏈黴素(STR)，SOmgF1 氯黴素(CHL)，SOOmgr1磺胺異惡挫(SFX)，200mgr1磷黴素(FOS)，SmgF1加替沙星(GAT)或 SOmgF1甲氧苄啶(TMP)的抗性平板上，常規培養，然後依據菌落鑑定手冊規定的指標，挑取單克隆菌落，繼續培養，獲得耐藥細菌；
2.以CTAB法分別提取獲得的耐藥細菌的基因組DNA;3.分別以篩得的耐藥細菌基因組DNA為模板，進行PCR擴增，取擴增後產物採用瓊脂糖凝膠電泳檢測所述耐藥菌中是否含有1型整合酶，以此確定所述菌是否為含1型整合子的耐藥細菌；其中上述PCR所用擴增引物為上遊引物intll-F :5，-GTTCGGTCAAGGTTCTGG-3，&下遊引物intll-R :5，-CGTAGAGACGTCGGAATG-3，；4.選擇步驟3確定的含1型整合子的陽性菌株，再分別以其基因組DNA為模板，進行PCR擴增，取擴增後產物採用瓊脂糖凝膠電泳檢測1型整合子的陽性菌株中是否攜帶基因盒陣列；其中所述的PCR擴增引物為上遊引物h印58 :5，-TCATGGCTTGTTATGACTGT-3，&下遊引物h印59 :5，-GTAGGGCTTATTATGCACGC-3，；5.選擇攜帶基因盒陣列的陽性菌株，切膠回收其攜帶的基因盒陣列DNA片段，以常規方法與PMD19-T Simple Vector連接，然後熱激轉化法轉入感受態細胞Ε. coli T0P10 中，以藍白斑實驗挑選陽性轉化子，測序；6.依據所選陽性菌株整合的基因盒陣列的測序結果，選定限制性內切酶EcoRII， 對所述陽性菌株中整合的非重複基因盒陣列DNA片段採用常規酶切體系於37°C消化3 6 小時，然後用瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切片段長度，構建出EcoRII的酶切圖譜庫如下
權利要求
1. 一種利用Ec0RII酶切圖譜庫檢測細菌整合子中基因盒陣列的方法，步驟是(1)取醫院周圍的廢水樣品，以0.22 μ m孔徑無菌濾膜過濾富集菌體，將膜轉接到LB 液體培養基中過夜培養，梯度稀釋菌液塗布於含有IOOmgr1氨苄西林，SOmgr1卡那黴素， SOmgF1四環素，SOmgr1頭孢他啶，lOmgl—1鏈黴素，SOmgl—1氯黴素，SOOmgl—1磺胺異惡挫， 200mgr1磷黴素，Smgr1加替沙星或SOmgl—1甲氧苄啶的抗性平板上，常規培養，然後依據菌落鑑定手冊規定的指標，挑取單克隆菌落，繼續培養，獲得耐藥細菌；(2)以CTAB法分別提取獲得的耐藥細菌的基因組DNA；(3)分別以篩得的耐藥細菌基因組DNA為模板，進行PCR擴增，取擴增後產物採用瓊脂糖凝膠電泳檢測所述耐藥菌中是否含有1型整合酶，以此確定所述菌是否為含1型整合子的耐藥細菌；其中上述PCR所用擴增引物為上遊引物 intll-F :5』 -GTTCGGTCAAGGTTCTGG-3』 &下遊引物 intIl-R:5，-CGTAGAGACGTCGGAATG-3，；(4)選擇步驟(3)確定的含1型整合子的陽性菌株，再分別以其基因組DNA為模板，進行PCR擴增，取擴增後產物採用瓊脂糖凝膠電泳檢測1型整合子的陽性菌株中是否攜帶基因盒陣列；其中所述的PCR擴增引物為上遊引物 h印58 :5』 -TCATGGCTTGTTATGACTGT-3』 &下遊引物 h印59 :5，-GTAGGGCTTATTATGCACGC-3，；(5)選擇攜帶基因盒陣列的陽性菌株，切膠回收其攜帶的基因盒陣列DNA片段，以常規方法與PMD19-T SimpleVector連接，然後熱激轉化法轉入感受態細胞E. coli TOPlO中，以藍白斑實驗挑選陽性轉化子，測序；(6)依據所選陽性菌株整合的基因盒陣列的測序結果，選定限制性內切酶EcoRIIji 所述陽性菌株中整合的非重複基因盒陣列DNA片段採用常規酶切體系於37°C消化3 6小時，然後用瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切片段長度，構建出Ec0RII的酶切圖譜庫如下基因盒陣列種類基因盒陣列長度(bp)EcoRll酶切圖譜長度(bp)不含基因盒陣列00orfl693433,161,99arr-3748748dfrA25765407,212,146aac(6')-Ib-cr999575,242,182aadA21009674,335aadA231011676,335WaPSE-I12731273dfrAl—orfC1318690,349,176, 102, 21arr-3一dfrA2713931393arr-3一aacA414711047242,182dfrAl—aadAl1662707,690,244, 21dfrA16~aadA21673966,70全文摘要
本發明公開了一種利用EcoRII酶切圖譜庫檢測細菌整合子中基因盒陣列的方法，是在確定新篩選出的基因盒陣列時，先採用限制性內切酶EcoRII對其進行酶切，與已構建的EcoRII酶切圖譜庫中的酶切圖譜比對，來確定新篩選基因盒陣列的新穎程度，若庫中無與其匹配圖譜，則再選擇連接、轉化、測序分析，實現了有目的的測序。本發明方法既準確快速又經濟節約，也便於信息共享。較適用於醫院、檢疫、測報、防治等有關部門在抗生素濫用還沒有得到很好遏制的情況下，實現有效地監測和防治含整合子耐藥細菌通過水平轉移傳播造成的耐藥細菌的爆發性流行。
文檔編號C12Q1/68GK102191322SQ20111008054
公開日2011年9月21日 申請日期2011年3月31日 優先權日2011年3月31日
發明者國憲虎, 夏蕊蕊, 徐海 申請人:山東大學