赤魟尾刺親環素a基因的克隆、表達及生物活性的製作方法

2023-04-24 10:51:06 1

專利名稱：赤魟尾刺親環素a基因的克隆、表達及生物活性的製作方法
技術領域：
本發明涉及赤魟尾刺親環素A(親環素A)基因的克隆、表達及生物活性。更具體說，本發明涉及從赤魟尾刺cDNA表達文庫總質粒出發，利用PCR方法篩選克隆出CypA全長基因，利用基因工程的方法，在高效大腸桿菌表達系統中表達並純化出具有生物活性的赤魟尾刺親環素A蛋白，通過重組赤魟親環素A蛋白的肽基脯氨酸順反異構酶活性鑑定和與環胞菌素A(CsA)結合親和力等功能的研究，確證其活性，作為藥靶用來篩選能與之高親和力結合的小分子化合物和傳統中藥組分等，為新的抗愛滋病毒藥物和免疫抑制劑的篩選奠定基礎。
Cyp家族包括多種成員，其中CypA是含量最多，最主要的一種，約佔細胞總蛋白的0.1％，其鏈長為165個胺基酸殘基，分子量為18kDa。CypA是於1984年由Fischer和他的研究夥伴最先發現的，同年，Handschumacher等人又發現其與免疫抑制反應藥物CsA的結合作用，即作為CsA受體的特性。而這種免疫抑制反應的結合作用是CsA/CypA複合物通過抑制Ca2+依賴性磷酸酶，即神經鈣蛋白(Calcineurin，CN)來調控的。另外，親環素在許多組織中可廣泛表達，尤其在腦組織和神經細胞中的濃度最高，它作為肽脯氨醯順反異構酶PPIase，在神經元蛋白成熟和摺疊中起重要作用，其主要表現在在蛋白摺疊過程中加快限速性異構化的進程。親環素還可以根據不同的靶細胞，表現為至少7種異構體，從而體現多種不同的功能。在包括酵母和哺乳動物等多種細胞中，親環素可以影響一種鋅指轉錄因子YY1並且同時調控其功能活性，而此時親環素A的肽脯氨醯順反異構酶活性可以以離子依賴性方式被鋅離子的結合所抑制，但是CypA-Zn2+複合物亦可識別並結合DNA序列並可能涉及到轉錄過程的調節。親環素同樣還可以作為一種類細胞因子，這一研究表明CypA可以調節CsA的神經毒性(neurotoxicity)，還可以在調控神經元功能上起到很重要的作用；Hovland等人的研究還發現，作為一種已知的神經毒素，CsA在神經細胞內表現出了對CypA水平調節的作用。已有實驗採用鼠的成神經細胞瘤(NB)進行研究，結果表明，單一的CsA就足以在未分化的NB細胞中導致其形態差異而引起CypA水平的提高(通過immunostaining檢測)。
另外，另一方面的實驗亦表明，通過RO20-1724以及PEG的作用可提高cAMP的水平並導致細胞的形態差異，但未發現可提高CypA的水平，而在不論是RO20-1724還是PEG所介導分化的NB細胞中CsA均起到了這種作用。由此可知，CsA在未分化或是cAMP介導分化的NB細胞中均起著調節其自身的結合蛋白(CypA)的水平的作用。並且，CsA通過與Cyp的結合抑制了CN磷酸酶的活性，從而調節著核轉運以及NFAT轉錄因子的活性。故而，了解在神經細胞中CypA水平的調節是相當重要的。
親環素有著多種的生物學功能。其主要有(1)參與蛋白質的摺疊、裝配和運輸肽脯氨醯順反異構是蛋白質摺疊的限速步驟，此異構過程可自主進行，也可由PPIase催化進行。Cyp是PPIase家族之一，體外實驗顯示出即使很小濃度的Cyp亦可促進各種蛋白質的摺疊，其中CsA與Cyp結合後可抑制其PPIase的活性，從而減慢蛋白的摺疊，但是就其機理而言尚不明確，可能是由於PPIase可減弱C-N的雙鍵特徵，使鍵能減小易於扭轉而導致加速異構所造成的；此外，Cyp還具有分子伴侶的作用，可減弱不完全摺疊多肽的聚集。大量的體外實驗已經證明了Cyp參與蛋白質摺疊的作用，與此相比，體內實驗對於Cyp在此方面的作用還需進一步的確證。
(2)參與免疫抑制Cyp與CsA結合的複合體與神經鈣蛋白(Calcineurin，CN)結合，抑制CN的活性來阻斷其脫磷酸，從而抑制NFAT向核內轉位，抑制NFAT與fos和jun(NFAT核內成分)結合，並抑制形成的Cyp-CsA-CN複合體與DNA結合。因此基因激活受到抑制，產生了免疫抑制。在沒有CsA的情況下，Cyp可與其天然配體結合抑制CN的活性，對集體免疫系統起調節的作用，而保持相對平衡。
(3)參與細胞凋亡細胞凋亡是染色質DNA片段化的表現，NUC18作為一種主要的核酸內切酶催化著這一過程，研究表明，CypA與NUC18有著及其相似的胺基酸序列，抗體之間亦有交叉反應性。由此，重組Cyp在變性與天然狀態均有這一內切酶活性，可降解單雙鏈DNA、超螺旋DNA以及RNA，當然這一特性與其所具有的PPIase活性無關。此外，研究發現，Cyp的濃度及其核酸酶活性在凋亡過程中不發生變化，因此可推測這一過程中Cyp所表現的核酸酶活性是被激化的。但是具體的激活機制尚不明確。
(4)發揮細胞因子的功能研究者在類風溼關節炎患者的關節液中發現了CypA，並且未發現關節液中細胞未有明顯的破壞，由此可以推知，CypA是由細胞分泌的，而並不是細胞破壞釋放的。實驗證明，牛和人重組CypA對於嗜酸性粒細胞和中性粒細胞的作用呈現被趨化的現象(CsA可抑制這一作用)，從而更確證了CypA作為細胞因子家族中又一成員所發揮的免疫調節及炎症反應等方面的作用。
(5)在多種疾病中的作用目前研究最多的是CypA在1型人免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus 1，HIV1)感染中所起的作用。研究發現CypA特異摻入HIV-1病毒顆粒中，且為HIV-1感染複製所必需。CypA作用於Gag蛋白，引導Gag蛋白的正確摺疊。而Gag蛋白則引導病毒顆粒的組裝，在逆轉錄病毒感染早期發揮重要的作用。Gag蛋白中一富含脯氨酸的區域可與CypA結合。除去CypA的HIV-1病毒感染能力明顯下降，由此證實了HIV-1的感染能力有賴於CypA的存在。CsA可阻斷Gag蛋白與CypA的結合，將其加入HIV-1感染的細胞培養液中可使HIV-1的表達和感染力下降。所以，儘管CsA具有抑制免疫反應的作用，但在愛滋病的治療應用尚仍存在一定的前景。
另外，研究又發現宿主細胞Cyp與利什曼原蟲(L.major)的胞內複製有關。CypA的反義寡核苷酸在利什曼原蟲感染前加入巨噬細胞培養液中可有效的抑制其胞內複製。此外，CypA與某些自身免疫疾病有一定的關係，其中包括，CypA存在於類風溼性關節炎患者的關節液中，對炎症的發生和發展有一定的促進作用。鑑於CypA基因在多種疾病中的作用機制的研究，提示著對這個CypA基因的深入研究在疾病的應用和新的免疫抑制劑的篩選方面有著誘人的前景。
序列分析表明赤魟親環素A基因與人同源物的核苷酸序列相似性高達84％；蛋白質序列同源性亦達72％。
本發明提供一種如序列表中序列號碼1所示核苷酸序列的DNA。
本發明提供一種如序列表中序列號碼1所示胺基酸序列的蛋白質。
本發明提供一種重組載體，該重組載體包括上述一種核苷酸序列。
本發明提供一種含有上述重組載體的原核細菌。
在一種實施方式中，上述原核細菌是大腸桿菌。
在一種實施方式中，上述載體使是以硫氧環蛋白為融合伴體，中間插入6個His的親和標記位點及蛋白酶3C識別位點的高效表達載體pTRX-cyp A。
在一種實施方式中，上述載體使所述DNA在大腸桿菌中以胞內可溶的形式表達，其表達量為40-60mg/L。
在一種實施方式中，上述重組載體的表達產物超音裂解液經過Ni2+-Chelating親和柱層析，蛋白酶3C切割和凝膠過濾可得到純度在95％以上的性質穩定的成熟蛋白，得率為5-8mg/L。
本發明還提供一種用作引物的DNA片段，該DNA片段由上述核苷酸序列的一部分序列組成。
本發明還提供一種含有上述蛋白的藥物靶標。
在一種優選實施方式中，是將上述藥物靶標通過所含蛋白的穩定的肽基脯氨酸順反異構酶活性以及與環胞菌素A的結合親和力，用於篩選抗愛滋病毒藥物和免疫抑制劑。
本發明所選擇的魟魚屬於赤魟(Dasytis akajei)，採購自廣東省湛江水產品市場。赤魟尾刺cDNA文庫的構建首先解剖分離到赤魟尾刺，提取總RNA；進行第一鏈合成，LD PCR cDNA擴增，酶切消化和柱回收cDNA構建表達文庫；隨機挑取小量文庫克隆測序獲得赤魟親環素EST。然後用PCR的方法從赤魟尾刺表達文庫總質粒中篩選克隆到親環素A全長基因，根據所獲得的親環素EST 3』端和載體核苷酸序列，設計引物，PCR擴增得到目的條帶，將目的條帶連接到T-easy載體，並轉化E.coli挑選重組克隆。
本發明通過對以上重組克隆進行序列測定，克隆獲得赤魟親環素A全長基因，並通過基因工程方法表達出重組蛋白。新基因編碼167個胺基酸的成熟肽，等電點約為8.34，分子量約為18,021道爾頓，具有典型的親環素A基因一級結構的特徵。其酶活性位點-環孢菌素A結合位點高度保守，即具有構建CsA結合位點的13個殘基(R55，F60，M61，Q63，G72，A101，N102，A103，Q111，F113，W121，L122和H126)中包括了結合必需的色氨酸和特徵性的豐富苯丙氨酸，而其N-和C-端功能域則多變。
本發明通過一對引物的設計，將編碼赤魟親環素A的基因用PCR方法從T-easy載體上擴增出來，克隆到中間質粒BSK後轉移至原核融合表達載體pTRX上，構建成表達質粒並將其轉化大腸桿菌BL21(DE3)(見圖3)。此表達載體(pTRX-cyp3c)以T7為啟動子，採用分子伴侶TRX為融合伴體，可幫助重組蛋白正確摺疊，以可溶的形式表達，TRX的C端有柔鏈區和6×His結構，便於利用固定化金屬配體親和層析進行純化。所設計的上遊引物含有蛋白酶3C位點，以便外源蛋白單體的獲得。通過對培養時間，誘導時間，溫度等條件的摸索和優化，Cyp3c融合蛋白的表達量可達到60mg/L，並且基本上處於可溶狀態。
本發明還摸索和優化了重組Cyp3c蛋白的純化條件，表達產物的超聲裂解液經Ni2+Chelating Sepharose親和色譜層析，得到純度較高的融合蛋白，融合蛋白經3C蛋白酶切割和進一步的G50凝膠柱層析，可得到純度在95％以上的成熟重組赤魟尾刺親環素A蛋白。
本發明獲得的重組赤魟親環素A蛋白是有生物活性的。
本發明獲得的重組赤魟親環素A蛋白具有肽基脯氨酸順反異構酶(peptidyl-prolyl cis-trans isomerases，PPIase)活性。對重組赤魟親環素A蛋白進行的活性實驗，利用糜蛋白酶偶聯法檢測重組赤魟親環素A蛋白的酶活，發現親環素A蛋白具有肽基脯氨酸順反異構酶催化活性(見FIG)。本發明利用分子生物學的方法，找到了1個赤魟親環素A新基因，並採用融合表達系統生產出具有肽基脯氨酸順反異構酶活性的重組赤魟親環素A蛋白，作為藥靶具有極高的應用前景及產業開發價值。
本發明的含有赤魟尾刺親環素A蛋白成熟肽編碼序列的表達質粒pTRX-Cyp3c(構建過程見圖3)已經保藏於中國典型培養物保藏中心(CCTCC，中國，武漢，珞珈山，武漢大學校內)，保藏號M201039，保藏日2001年10月26日。
由該表達質粒載體經Kpn I/Not I雙酶切，可得到540bp的片段，即為赤魟尾刺CyclophilinA成熟肽編碼序列(其中包含蛋白酶3C識別位點)(酶切結果見圖4)本發明的表達質粒載體的複製方法參照Sambrook(Sambrook，et al.1989，Molecular cloing.Cold Spring Harbor Labroratory Press.USA)方法，按CaCl2法在E.Coli.DH5α或BL21(DE3)菌株中轉化質粒，用含氨苄青黴素(100μg/mL)的LB培養基轉化細菌，鹼法提取質粒。
圖2赤魟尾刺親環素A蛋白基因的PCR電泳結果。其中1.PCR目的條帶；2.1kb DNA標記。
圖3含赤魟尾刺親環素A蛋白基因的重組質粒pPTRX-Cyp3c表達質粒構建圖。
圖4含赤魟尾刺親環素A蛋白基因的BSK-Cyp3c中間質粒和pPTRX-Cyp3c表達質粒酶切鑑定圖。其中，M1Kb DNA Ladder(Gibco)；lane 1pTRX-Cyp3c載體質粒KpnI，NotI雙酶切產物；lane 2pTRX-Cyp3c載體質粒；lane 3BSK-Cyp3c載體質粒的KpnI，BamHI雙酶切產物；lane 4BSK-Cyp3c載體質粒。
圖5A和圖5B為重組赤魟尾刺親環素A蛋白誘導表達、純化rCypA電泳圖。
圖5A為不同收菌時間，同一IPTG誘導濃度的蛋白表達，其中C未加IPTG誘導的總菌體；M蛋白質低分子標記(6條帶分子量如圖F中所示)；Lane 1，2，3，4誘導10小時(7+3)，IPTG誘導濃度依次為0.5mM、0.25mM、0.1mM、0.01mM；Lane 5，6，7，8誘導11小時(7+4)，IPTG誘導濃度依次為0.01mM、0.1mM、0.25mM、0.5Mm。、圖5B為純化rCypA的SDS-PAGE電泳圖，其中M蛋白質低分子標記；1.未加IPTG誘導的pTRX-Cyp3c BL21(DE3)菌體；2.加0.1mM IPTG誘導的pTRX-Cyp3c BL21(DE3)菌體；3.純化的赤魟rCyPA。
圖6為重組赤魟尾刺親環素A蛋白親和層析圖譜。BB液洗脫；CC液洗脫；DD液洗脫；EE液洗脫.
圖7為重組赤魟尾刺親環素A蛋白分子篩層析圖譜，其中A第1峰；B第2峰；C第3峰。
圖8為表示糜蛋白酶偶聯法測定重組赤魟CyPA的PPIase活性的示意圖。
實施例1赤魟尾刺總RNA的提取、文庫構建和PCR克隆篩選總RNA的提取和cDNA合成解剖二條赤魟尾刺，採用異硫氰酸胍法提取觸手總RNA，酚/氯仿抽提去除蛋白質.獲得65μg尾刺總RNA，其A260/A280＝1.98，經1％甲醛變性膠電泳檢測可見清晰的28s和18s兩條帶，比值＞2，以及mRNA smear(見

圖1)，表明總RNA完整性良好。進行第一鏈合成，LD PCR cDNA擴增，酶切消化和柱回收cDNA，構建cDNA文庫。
引物設計和PCR擴增根據文庫少量克隆隨機測序結果所獲得的親環素(CyP)EST 3』端和載體核苷酸序列，設計引物，T7引物5』-TAA TAC GAC TCACTA TA-3』；CyPA引物5』-TTG TTC CCA AAC AAT CAC-3』。每50μl PCR反應體積加入1μl文庫總質粒作為模板，PCR擴增，電泳檢測，發現在650bp附近出現預期的特異性擴增帶(見圖2)，回收此帶。實施例2重組赤魟尾刺CypA基因序列的測定和分析將回收的電泳產物連接至T-easy載體，轉化DH5 α大腸桿菌，挑選重組克隆測序。一共測定了12個克隆，Blast同源分析表明，其中有7個是親環素A基因序列，這7個親環素A基因長度都是656bp，編碼1個長度為167個胺基酸的青環素蛋白，編號為Ch120。它與人同源物的核苷酸序列相似性高達84％；和已報導CyPA蛋白質序列同源性亦達72％但不完全相同。在赤魟中未見報導，是1個新的親環素A蛋白。
利用工具軟體DNAtools對其鹼基序列(如上圖)進行分析，並獲得其最大讀碼框，在靠近5』端處出現起始密碼子ATG，並且在ATG前還發現了一段特徵性的崗崎片段(GCAGCGCC)，以及在緊跟ATG後出現一個限定性鹼基G，由統計學的角度考慮以上兩個條件，可以確認緊跟其後出現的ATG為CypA全長序列的起始密碼子；序列分析還發現，在靠近3』端終止密碼子處發現一個加尾信號(AATAAA)，並且在3』端處的確出現了polyA序列，由此亦可以確認此序列已經終結。故根據以上的多方面分析可以判斷本實驗所採用的CypA基因序列為全長序列。另外通過Clustalw分析軟體可得如下比較結果Hom ------------------MVNPTVFFDIAVDGEPLGRVSFELFADKVPKTAENFRALSTGMus ------------------MVNPTVFFDITADDEPLGRVSFELFADKVPKTAENFRALSTGRat ------------------MVNPTVFFDITADGEPLGRVCFELFADKVPKTAENFRALSTGDro ------------------MSLPRVYFDIAAGGEKLGRIVMELRSDVVPKTAENFRALCTGch120 ----------------MANKKPRVFMDISIGGKPQGRITMELNADVVPKTAENFRALCTG*:: **: :** * ***********.**Hom EKGFG-------YKGSCFHRIIPGFMCQGGDFTRHNGTGGKSIYGEKFEDENFILKHTGPMus EKGFG-------YKGSSFHRIIPGFMCQGGDFTRHNGTGGRSIYGEKFEDENFILKHTGPRat EKGFG-------YKGSSFHRIIPGFMCQGGDFTRHNGTGGKSIYGEKFEDENFILKHTGPDro EKGYG-------YKGSPFHRVIPNFMCQGGDFTNQNGTGGRSIYGNKFPDENFELKHTGAch120 EKGFG-------YKGSTFHRIIPGFMCQGGDFTRHNGTGGKSIYGEKFKDENFQLKHTVP*** * :*** ***:** ** ******. :****.**** ** **** **** .
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Hom ITIADCGQLE--Mus ITISDCGQL---Rat ITISDCGQL---Dro VIIEDCGAL--ch120 VEITDCGELS--「*」表示相同；「:」表示差異較小；「.」表示差異明顯；空格表示完全不同。
由上分析結果可以看出，本實驗採用的赤魟CypA基因與其他物種的同種基因具有較高的同源性，具有典型的親環素A基因一級結構的特徵。其酶活性位點-環孢菌素A結合位點高度保守，即具有構建CsA結合位點的13個殘基(R55，F60，M61，Q63，G72，A101，N102，A103，Q111，F113，W121，L122和H126)中包括了結合必需的色氨酸和特徵性的豐富苯丙氨酸，而其N-和C-端功能域則多變。
在PCR擴增反應中，用普通的Taq酶會出現約10-4的錯配，由於目的片段不大，PCR的循環數不超過30個，降低了錯誤參入的概率，從實驗結果來看，這個序列在多個克隆測序中重複出現，可排除錯誤參入，說明本實驗PCR的結果有較高的可信度。實施例3重組赤魟尾刺親環素A蛋白表達質粒的構建依據赤魟尾刺親環素A基因的兩端序列合成一對引物，在上遊引物中引入KpnI酶切位點(GGTACC)、ATG起始密碼子、以及一個Prescission Protease切割位點，下遊引物中引入BamH I酶切位點(GGATCC)及終止密碼子TTA，TCA。
上遊引物(P1)5』-GGGGTACCCTGGAAGTTCTGTTCCAAGGTCCAATGKpn I Precision Protease siteGCCAACAAGAAGCCCA-3』下遊引物(P2)5』-CGGGATCCTTATCAGGACAACTCCCCACAAT-3』BamH I以含親環素A基因的pGEM-T easy質粒為模板，P1、P2為引物PCR擴增，得到特異擴增的單一條帶，產物大小在550bp左右。PCR擴增產物先以Kpn I/BamHI雙酶切後連接到BSK載體上構建成BSK-CyPA，再以Kpn I/Not I的酶切克隆到原核融合表達載體pPETTRX上。克隆載體和表達載體分別用Kpn I/BamH I和KpnI/Not I進行雙酶切鑑定(酶切結果見圖4)。克隆載體和表達載體中的外源基因經測序鑑定正確。所設計的上遊引物中含Pre-scission蛋白酶切割位點，以便切除融合伴侶TRX。實施例4 重組赤魟尾刺親環素A融合蛋白的表達將pTRX-親環素A轉化大腸桿菌BL21(DE3)。基因工程菌超聲裂解上清液經SDS-PAGE電泳分析表明，菌體經誘導後有明顯的特異表達產物帶，分子量與用軟體PROTEIN ANALYSIS預測的理論值32.4kD相符。
經過對培養時間，誘導濃度，溫度等條件的摸索(見圖5)菌體擴大培養不同時間後誘導表達比較)，基因工程菌的培養條件為接單菌落於50ml氨卞抗性LB培養基中，37℃，250rpm培養過夜，取過夜培養物20ml接種於2L的氨卞抗性LB培養基中，37℃，250rpm培養至OD600＝0.6(擴大培養約2h)，加入100mM IPTG和20％葡萄糖至終濃度分別為1mM和0.2％，25℃，250rpm誘導培養10h後離心收穫菌體。經SDS-PAGE電泳分析分析表明，在此條件下赤魟尾刺Trx-親環素A融合蛋白的表達量佔菌體總蛋白的20％以上，基本上處於可溶狀態(見圖5)。實施例5 重組赤魟尾刺親環素A融合蛋白的純化及成熟蛋白的獲得將收穫的總菌體用TE(pH8.0)洗滌，再用Tis(50mM，pH7.0)懸浮，超聲處理後，裂解上清液經Ni2+Chelaing Sepharose親和色譜層析一步純化，經SDS-PAGE分析和薄層掃描分析表明融合蛋白的純度達到約80％(圖5B、6、7)。以1L基因工程菌培養物為材料，最終獲得約60mg純化的融合蛋白。
為了提高重組蛋白的得率和濃度，簡化實驗步驟，縮短對重組蛋白的處理時間，在用Ni2+親和色譜層析純化重組蛋白時，採用一步法進行了純化。根據載體質粒pETTRX所表達的外源蛋白與Ni2+親和柱的結合能力較強的特點，我們選用了較簡化的洗脫條件50mMPB，500mMNaCl，pH7.0(A液)；50mMPB，500mMNaCl，pH6.0(B液)；150mM咪唑，50mMPB，500mMNaCl，pH6.0(C液)；300mM咪唑，50mMPB，500mMNaCl，pH6.0(D液)；500mM咪唑，50mMPB，500mMNaCl，pH6.0(E液)。重組CyPA蛋白在D液和E液被洗脫下來(圖6)。從SDS-PAGE結果來判斷分離效果最好的部分。
利用Folin-酚法測定重組CyPA的蛋白濃度，收穫濃度在0.7mg/ml以上的洗脫液，加入Precision Protease進行切割，用SDS-PAGE檢測酶切結果，可明顯看到18kD附近代表成熟rCyPA的譜帶(見圖5B)。將反應液用Ni2+ChelatingSepharose親和色譜層析柱純化(條件同前)，收穫含成熟rCyPA的穿流液，並用Sephadex G-50進一步純化(洗脫液為PBS)，便得純度在95％以上的成熟重組赤魟尾刺親環素A(見圖7)。實施例6 重組赤魟CyPA蛋白PPIase活性的測定重組CyPA的生物活性參照Fischer等人建立的糜蛋白酶偶聯法，略加改進。反應體積2ml，含35mmol/L Hepes(PH8.0)、100μmol/L N-succinyl-Ala-Ala-Pro-Phe-p-nitroanilide(溶於66％DMSO水溶液中)、10μmol/L糜蛋白酶、rCyPA的濃度為25nmol/L。除糜蛋白酶外的所有成分混合後預置在15℃，糜蛋白酶加入後迅速混勻，UV-260分光光度計連續測定A390值，直到反應終止，繪製曲線圖。其結果見圖8。
序列表1.一般信息(i) 申請人北京博奧環宇生物技術有限公司(ii) 發明名稱赤魟尾刺親環素A基因的克隆、表達及生物活性(iii)序列數目2序列號1序列長度656bp序列類型鹼基對鏈數雙鏈拓 撲 學直鏈狀序列種類DNA起源生物赤魟(Dasytis akajei)株名大腸菌BL21(DE3)序列特徵表示特徵的記號有正確的讀碼框決定位置起始、終止密碼子決定特徵的方法實驗存在位置起始密碼子存在於第83-85位，終止密碼子576-578位GNGACTGCAT TGNCANNGNC TGACCAAGTC AGTATACGGC CTACCGCTCG CATTTCTCTC 60CGGCCTCAGA AGCT ATG CC AAC AAG AAG CCC AGG GTC TTT ATG GAC ATC 118Met Ala Asn Lys Lys Pro Arg Val Phe Met Asp IleTCC ATT GGG GGT AAA CCC CAG GGT CGC ATA ACG ATG GAG CTA AAC GCA GAT 169Ser Ile Gly Gly Lys Pro Gln Gly Arg Ile Thr Met Glu Leu Asn Ala AspGTT GTC CCA AAG ACT GCA GAA AAC TTC CGT GCA CTA TGC ACA GGC GAG AAG 220Val Val Pro Lys Thr Ala Glu Asn Phe Arg Ala Leu Cys Thr Gly Glu LysGGT TTC GGT TAC AAA GGC TCA ACG TTC CAC AGA ATC ATT CCT GGA TTC ATG 221Gly Phe Gly Tyr Lys Gly Ser Thr Phe His Arg Ile Ile Pro Gly Phe MetTGC CAG GGT GGT GAC TTC ACA AGG CAT AAC GGC ACT GGA GGC AAG TCC ATC 322Cys Gln Gly Gly Asp Phe Thr Asp His Asn Gly Thr Gly Gly Lys Ser IleTAT GGG GAG AAG TTT AAA GAT GAG AAT TTT CAG CTG AAG CAC ACA GTG CCA 373Tyr Gly Glu Lys Phe Lys Asp Glu Asn Phe Gln Leu Lys His Thr Val ProGGC ATC CTG TCC ATG GCC AAT GCT GGA CCA AAT ACA AAT GGT TCC CAG TTC 424Gly Ile Leu Ser Met Ala Asn Ala Gly Pro Asn Thr Asn Gly Ser Gln PheTTC ATA TGC ACC ACA ATA ACT AGT TGG TTG GAT GGG AAG CAT GTT GTG TTT 475Phe Ile Cys Thr Thr Ile Thr Ser Trp Leu Asp Gly Lys His Val Val PheGGA TCA GTG GTA GAA GGC ATG GAT GTG GTA ACG AAG ATG GAG AAG TGT GGC 526Gly Ser Val Val Glu Gly Met Asp Val Val Thr Lys Met Glu Lys Cys GlyGAC AAG TCT GGA AAA CCC AGT GCC ACG GTT GAG ATC ACT GAT TGT GGG GAG 577Asp Lys Ser Gly Lys Phe Ser Ala Thr Val Glu Ile Thr Asp Cys Gly GluTTG TCCTGAATTATTT GAATTTGCAA TTTTATGATT TA AGTGTGAT TGTTTGGGAA 639Leu Ser*CAACAAAAAAAAAAAAA
權利要求
1.一種如序列表中序列號碼1所示核苷酸序列的DNA。
2.一種如序列表中序列號碼1所示胺基酸序列的蛋白質。
3.一種重組載體，該重組載體包括如權利要求1所述的核苷酸序列。
4.一種含有如權利要求3所述的重組載體的原核細菌。
5.如權利要求4所述的原核細菌，其特徵在於所述的原核細菌是大腸桿菌。
6.如權利要求3所述的重組載體，其特徵在於所述載體是以硫氧環蛋白為融合伴體，中間插入6個His的親和標記位點及蛋白酶3C識別位點的高效表達載體pTRX-cyp A。
7.如權利要求3所述載體，其特徵在於該載體使所述DNA在大腸桿菌中以胞內可溶的形式表達，其表達量為40-60mg/L。
8.如權利要求3所述重組載體，其特徵在於由該重組載體的表達產物超音裂解液經過Ni2+-Chelating親和柱層析，蛋白酶3C切割和凝膠過濾可得到純度在95％以上的性質穩定的成熟蛋白，得率為8-10mg/L。
9.一種用作引物的DNA片段，其由權利要求1所述核苷酸序列的一部分序列組成。
10.一種含有如權利要求2所述蛋白的藥物靶標。
11.如權利要求10所述藥物靶標，通過所述蛋白的穩定的肽基脯氨酸順反異構酶活性以及與環胞菌素A的結合親和力，用於篩選抗愛滋病毒藥物和免疫抑制劑。
全文摘要
本發明通過構建赤魟(Dasytis akajei)尾刺cDNA文庫和DNA測序，並根據所獲得的親環素(CyP)EST 3』端和載體核苷酸序列，設計引物，用PCR的方法，首次從赤魟尾刺cDNA文庫中篩選克隆到親環素A全長基因。新基因長度為656bp，編碼167個胺基酸的成熟肽，所表達的蛋白質等電點為8.34，分子量約為18,021道爾頓。將赤魟尾刺親環素A基因克隆於硫氧還蛋白基因融合表達載體pTRX的trxA基因3』末端，構建符合讀碼框的融合基因，該融合蛋白在大腸桿菌中以胞內可溶的形式存在，表達量可達60mg/l。通過Ni－Chelating親和色譜層析，蛋白酶3C切割和凝膠過濾，得到純度在95％以上成熟的重組赤魟親環素A蛋白，得率為10mg/l。該蛋白具有肽基脯氨酸順反異構酶活性。
文檔編號C12P19/34GK1428348SQ01136940
公開日2003年7月9日 申請日期2001年12月25日 優先權日2001年12月25日
發明者徐安龍, 塗洪斌, 熊茜 申請人:北京博奧環宇生物技術有限公司