預防和控制蜜蜂的病原感染的方法及相關組合物的製作方法
2023-05-07 23:03:11
專利名稱：預防和控制蜜蜂的病原感染的方法及相關組合物的製作方法
技術領域：
本發明涉及用於預防和控制在蜜蜂(Apis mellifera)中發生的病原感染的方法。
背景技術：
在過去20年間，養蜂地區在世界範圍內極其一致的記錄了蜜蜂數量和生產力的丟失。這些事實對農業-食品領域的更大規模也具有不利的影響。僅在2007年，與該災難同時發生的若干要素就導致整個義大利和歐洲養蜂資產損失30-50%，在USA的一些地區損失峰值達60-70%。其破壞並不局限於昆蟲死亡或生物多樣性的丟失。由於傳粉不足對季節性收穫的負面影響，整個農業-食品領域都受到該問題的困擾。在經濟上，與之對應的損失約為10億歐元/年，分布如下美國2千萬，中國7千萬，歐洲5億，世界其餘地區4·億。義大利僅在2007年就有20萬個蜂箱遭到破壞，導致約2. 5億歐元的、與缺少傳粉相關的經濟損失(等於1240歐元/蜂箱)(根據APAT—一環境保護和技術服務部(Agency forthe environmentalprotection and technical services)於 2008 年 I 月 29 日發出的通告)。導致這一高死亡率的可能原因是蜂箱的衛生條件、天氣變化、飼料和水的可利用度和質量、電磁汙染和植物藥物產品(新菸鹼類(neonicotinoid))有關的汙染。這些脅迫因子作用於減少蜜蜂免疫防禦力，因而使其對於微生物和病毒感染更加虛弱。對微生物和病毒疾病的控制是艱巨的難題，因為目前尚無用於該目的的專門的註冊藥物。唯一的解決手段是預防，例如阻止病毒或細菌的負荷達到導致誘導感染的水平。這可以通過採用所謂的Good Apiary Practice來實現，即，在蜂箱內避免材料交換、消毒設備和保持良好的通風。然而，該Good Practice仍不充分，傳染事件的數量仍然持續攀升。其中，美國幼蟲腐臭病(AFD)—一蜜蜂幼蟲最危險的疾病——受到最多關注，因其目前尚無角軍決方案(Genersch E. , 2009. American Foulbrood in honeybeesand itscausative agent, Paenibacillus larvae. J Invertebr Pathol. 103Suppll :S10_9)。AFD
的病原是產孢子細菌-幼蟲類芽孢桿菌(Paenibacilluslarvae) (Genersch等人,2006.
Reclassification of Paenibacillus larvaesubsp. pulvifaciens and Paenibacilluslarvae subsp larvae as Paenibacilluslarvae without subspecies differentiation.1nt J Syst Evol Microbiol56 :501-511)。有四個亞類屬於幼蟲類芽孢桿菌ERIC1、ERIC I1、ERICII1、ERIC IV，每個亞類都具有特定的表型特徵(Raugh等人，2009.Negative correlation between individual-1nsect level virulence andcolony-levelvirulence of Paenibacillus larvae, the etiological agent ofAmerican foulbroodof honeybees. Appl Environ Microbiol75 :3344-3347)。ERIC I 和 ERIC II 是最普及的。該微生物優先感染幼小的幼蟲。通過仍然保持健康的成蟲進食進行傳遞。在歐洲，禁止使用抗生素控制ΑΠ)傳播，因為這可能導致出現抗生素抗性病原體以及出於食品安全的原因(Miyagi T.，Peng C. Y. S.，Chuang R. Y.，Mussen E. C.，Spivak M. S.，Doi R. H.，2000.Verification of oxytetracycline-resistant Americanfoulbrood pathogenPaenibacillus larvae in the United States. Journal oflnvertebrate Pathology 75:95-96)。與此同時，根據義大利法律，向當局報告出現在任何蜂箱中的AFD是強制性的。此夕卜，根據 Veterinary Police 規定(D. P. R. 8/2/54，η. 320，art. 154-158)，由於缺少任何特異性的治療，唯一可接受的解決方案是毀壞受汙染的蜂箱。該嚴厲手段的目的是避免存在任何可能復發的感染病灶集中點(focuses)。如上所述，在絕大多數情況下，使用Good Apiary Practice不足以避免感染病灶集中點的存在。領域現狀想要作為預防蜜蜂的微生物病狀的潛在手段的市場上唯一可獲得的產品是ApiGo (Chemicals LAIF)。這是一種蜜蜂的飼料添加劑,用麥芽糖糊精、酵母提取物和維生素製備而成。它被認為是重新平衡蜜蜂成蟲和幼蟲的胃腸道微生物群(miCTobiota)的益生元。然而，對義大利3個地區(即，Piemonte、Lombardia和Emilia Romagna)的養峰人
R&D目前關注於鑑別以蜜蜂保護、養峰業產品的健康和終端用戶(消費者)安全性 為目的的、環境友好的解決方案。US2009/0104288A1公開了蛇麻草(hop)提取物限制蜜蜂的病原體擴散的用途。US2002/0034529A1 公開了使用塵埃幼蟲類芽孢桿菌(Paenibacilluslarvaepulvifacens)的菌株作為幼蟲類芽抱桿菌larvae種(Paenibacilluslarvae larvae)的拮抗劑。然而，塵埃幼蟲類芽孢桿菌是一種病原體，即使它毒力低。Evans 和 Lopez(Evans J. D. , Lopez D. L. ,2004. Bacterial probioticsinducean immune response in the honey bee(Hymenoptera Apidae). J. Econ. Entomol. 97 752-756)顯示，設計用於人類消費的益生菌混合物可以增加兩種具有抗微生物活性的肽(abaecin和防衛素)在蜜蜂中的生產。工作最後提示使用這些細菌作為蜜蜂的益生菌。Evans和Armstrong通過metagenomic方法鑑別了至少4種可以在體外抑制幼蟲類芽孢桿菌生長的微生物(嗜麥芽糖寡養單胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)、不動桿菌屬物種(Acinetobacter sp. )、Brevibacillus formosus 和梭狀芽抱桿菌(Bacillusfusiformis))。抑制作用涉及細菌素(bacteriocines)的生產(Evans J. D. , ArmstrongT. N. ,2006.Antagonistic interactions between honey bee bacterial symbiontsandimplications for disease. BMC Ecol.6,4)。Yoshiyama 和 Kimura 提供了關於生產針對其他菌株的細菌素的相同證據(Yoshiyama M.，Kimura K. , 2009. Bacteria in the gutof Japanese honeybee,Apis cerana japonica,andtheir antagonistic effect againstPaenibacillus larvae, the causal agent ofAmerican foulbrood.J.1nvertebr.Pathol. 102 :91-96)。Forsgren 等人(Forsgren E. , Olofsson T. C. , Va' squez A. , Fries1. , 2010.Novel lactic acid bacteria inhibiting Paenibacillus larvae in honey beelarvae.Apidologie 41 :99-108)提出使用從蜜蜂腸道分離的乙酸乳酸菌(acetic lacticbacteria)對抗幼蟲類芽孢桿菌感染。顯示了該方法在體外和體內的效果。提出了兩種可能的作用機制i)由於產生有機酸導致pH減少；ii)產生細菌素。Sabat6等人(Sabat6D. C.，Carrillo L. ,Audisio M. C. ,2009.1nhibition of Paenibacillus larvae and Ascophaeraapis by Bacillus subtilisisolated from honeybee gut and honey samples. Res.Microbiol. 160 :193-199)還提出使用從蜜蜂的內臟器官和蜂蜜中分離的細菌(即，枯草芽孢桿菌(Bacillus subtiluis))來控制幼蟲類芽孢桿菌和蜜蜂球囊菌(Ascosphaeraapis)。最後，Alippie Reynaldi (Alippi A. M. , Reynaldi F. J. , 2006.1nhibitionofthe growth of Paenibacillus larvae, the causal agent of American foulbroodofhoneybees, by selected strains of aerobic spore-forming bacteria isolatedfromapiarian sources. J.1nvertebr. Pathol. 91 :141-146)研究了一些分離物抑制幼蟲類芽抱桿菌的能力。在生物化學水平進一步探討了 10個最令人感興趣的菌株，以鑑別可能參與抑制幼蟲類芽孢桿菌的那些因素。發明定義目前發現蜜蜂的一些微生物共生生物可以對成蟲和幼蟲都具有益生效果，並可以具有免疫刺激效果。因此，預防和控制病原體感染對其特別感興趣。
更具體而言，本發明涉及菌株的混合物，所述菌株具有益生菌活性，並能夠預防由
AFD的病原-幼蟲類芽孢桿菌和由蜂房蜜蜂球菌(Melissococcus pluton)(歐洲幼蟲腐
臭病(European Foulbrood Disease))導致的細菌感染。本發明包括一種或多種產孢子細菌(即蘇雲金芽孢桿菌(Bacillusthuringensis)和側抱短芽抱桿菌(Brevibacillus Iaterosporus)),可能但不必需的聯合一種或多種從蜜蜂或其它傳粉者中分離的乳酸細菌(例如，Saccharibactersp.)的用途。上述三種微生物物種的應用被認為產生了強化免疫系統的益生元效果，從而導致預防一些蜜蜂病原體的感染。本發明的方法包括用本發明混合物對蜜蜂、幼蟲、蜂箱和所有其它組分的預防性處理。針對觀察益生菌混合物抗幼蟲類芽孢桿菌的效果所進行的具體實驗顯示通過多種作用機制，所述混合物在保護蜜蜂的成蟲和幼蟲中具有升高的潛力。處理導致抗外部脅迫的更高的保護作用，以及蜜蜂一般健康的實質性改善。比較性實驗顯示了混合物比單一菌株在預防感染中更有效，在所述實驗中蜜蜂的幼蟲在經過或未經過本發明的微生物菌株預處理的條件下，暴露於幼蟲類芽孢桿菌下。顯示了本發明的特定微生物混合物能夠產生針對病原體的直接拮抗作用，同時能夠刺激蜜蜂的免疫系統。該刺激作用在大範圍內以若干協同機制發生。這降低了出現針對本發明作用的抗性的可能性。這是極大的優勢，因為出現抗性菌株是仍然允許使用抗生素的那些國家中的主要問題(Lodesani M. , Costa C. , 2005. Limits of chemotherapy inbeekeeping-development of resistance and the problem of residues, Bee World86 102-109)。此外，作用的廣譜性(wide spectrum)可以導致還有效針對其它病毒或微生物疾病。更具體而言，對蜜蜂的體內研究顯示本發明特異性的細菌混合物能夠-修飾胃腸道的pH，因此產生對於病原體不利的環境；-在蜜蜂的胃腸道中建群，誘導競爭性排除病原體的機制；-同時激活蜜蜂的三種調控免疫系統的機制i)產生抗微生物肽(AMP)，ii)產生參與調控黑變作用過程的酶一 氧化酶；iii)產生溶菌酶；
-產生AFD病原體拮抗性的細菌素。總而言之，本發明特定的益生菌混合物是蜜蜂collapsing疾病問題的生物學的、因而也是環境友好型的解決方案，它利用作為蜜蜂的共生生物的、從昆蟲自身分離的細菌。牛物質製品通過單個菌株的發酵工藝，再凍幹細菌生物質，來製備乾燥生物質。散布細菌混合物的劑型和手段散布本發明的細菌混合物的製劑和相關手段的例子是(但不限於)1.蒸發或噴霧預先稀釋在淨水中的細菌生物質的的粉末。該製劑可以直接散布在蜜蜂成蟲、幼蟲和能與昆蟲接觸的任何養蜂設備上。建議劑量是每個蜂箱200mL細菌懸浮液，終濃度範圍從IxlO3至lxl09cfu/mL,更具體是從IxlO5至lxlO7。2.施用在漿內的乾燥生物質。漿是基於糖的產品，通常被散布在每個蜂箱的給食袋(feeding pocket)中。建議劑量是每個蜂箱700mL細菌懸浮液，懸浮液終濃度範圍從IxlO3 至 lxl09cfu/mL,更具體是從 IxlO5 至 IxlO703.施用實心棒或餅。將細菌生物質溶解在基於糖的液體中，然後將其硬化並導入蜂箱頂蓋下。建議劑量是每個蜂箱500mL細菌懸浮液，懸浮液終濃度範圍從IxlO3至lxl09cfu/mL,更具體是從 IxlO5 至 lxlO7。實驗部分已經在體外和體內研究中探討了本發明特定的微生物混合物抗病原體的效果和對於蜜蜂健康的效果。研究的主要階段如下進行。1.從表現出美國幼蟲腐臭病症狀的密蜂幼蟲中分離幼蟲類芽孢桿菌larvae種菌株從表現出AFD症狀的突尼西亞和義大利蜂箱取樣10條幼蟲。如文獻所述，在含有哥倫比亞血瓊脂(Columbia blood agar)的培養基上進行分離幼蟲類芽孢桿菌larvae 種(Genersch 等人，2006. Reclassification ofPaenibacillus larvae subsppulvifaciens and Paenibacillus larvae subsplarvae as Paenibacillus larvaewithout subspecies differentiation.1nt J SystEvol Microbiol 56 :501-511 ；Bakonyi 等人，2003. Development andevaluation of PCR assays for the detection ofPaenibacillus larvae in honeysamples comparison with isolation and biochemicalcharacterization. ApplEnviron Microbiol 69 :1504-1510)。通過 16S rRNA基因測序和使用引物ERIC的基因組重複序列擴增(rep-PCR),進行類芽孢桿菌屬(Paenibacillus spp.)的301株分離菌的分子分型。將16S rRNA序列與國際資料庫中可獲得的數據比對，而將ERIC譜與文獻中可獲得的比較。在301株分離菌中的2株被鑑定為ERIC I和ERIC II。這是類芽孢桿菌屬傳播最廣的菌株，因此使用這兩株分離菌進行所有的其它實驗。2.從健康蜂箱的密蜂幼蟲和成蟲中分離共牛細菌選擇一個沒有AFD症狀的義大利蜂箱作為環境資源，分離具有潛在益生菌活性的細菌。通過16S rRNA基因測序，鑑別出共270株分離菌，在第2個階段，根據其代謝能力將分離菌分組。鑑別出2個主要組i) 196株乙酸細菌；ii)64株產孢子細菌。3.體外篩詵抗幼蟲類芽孢桿菌larvae種的拮抗活件產孢子細菌
通過抑制測定，在體外測試64株產孢子細菌，以研討針對之前選定的2株幼蟲類芽孢桿菌larvae種ERIC I和ERIC II菌株的拮抗活性。測試是在Tryptic Soy Agar (TSA)上進行的，如 SabatS 等人，2009 所述(SabateD. C.，Carrillo L.，Audisio M. C. , 2009.1nhibition of Paenibacillus larvaeand Ascophaera apis by Bacillus subtilisisolated from honeybee gut andhoney samples. Res. Microbiol. 160 :193-199)。在37°C孵育48h後，測量生長在測試菌株周圍的幼蟲類芽孢桿菌larvae種的抑制暈圈，評估拮抗活性。根據該測試的結果，選擇2個產生較大暈圈的菌株(即，蘇雲金芽孢桿菌(Bacillus thuringensis)和側抱短芽抱桿菌(Brevibacillus Iaterosporus))進行進一步的實驗。評估了選定的細菌對於不同濃度的幼蟲類芽孢桿菌larvae種菌株ERIC I和ERICII的拮抗作用效力(表I)。使用大腸桿菌菌株作為陰性對照。 表1:由於存在選定的產孢子共生生物導致的幼蟲類芽孢桿菌larvae種生長的抑制暈圈的直徑(cm)
幼蟲類芽孢桿菌larvae種(it) 幼蟲類芽孢桿菌larvae種(til)
-1·EMCIJvKIC ii
20 μ *50 μ!4I鋳 μ *20 μ *50 μ *100 μΙ#
OOO2.82.1BI
蘇雲金芽筢桿菌 OOOND2.2BI
OOOND2,3麗
OOOND2.2BI
23.2BI1.9 1.51.3
側孢短芽孢桿菌1·9 2-° 81 19L8
IMD 2.0 BI U 1.5 1.3
ND2.5BI 1.81.B1.7
000 000
大潘桿菌 000__OOO
~^00 0OO I
OOOOOO IND =未檢測到；BI =模糊的抑制；* =在106/ml CFU/mL的濃度下基於產孢子細菌的拮抗活性的作用機制是產生細菌素。乙酸細菌以產生對抗幼蟲類芽孢桿菌larvae種有活性的細菌的協同混合物為目標，研究了從蜜蜂中分離的196株乙酸細菌的代謝活性。更具體的是，研究了通過產生乳酸造成的pH改變如何在不影響蘇雲金芽孢桿菌和側孢短芽孢桿菌的生長的條件下，對抑制病原體生長發揮作用。在表2中，報導了幼蟲類芽孢桿菌larvae種ERIC I和ERIC I1、蘇雲金芽孢桿菌和側孢短芽孢桿菌的菌株能夠生長的pH範圍。表2 :幼蟲類芽孢桿菌larvae幼蟲、蘇雲金芽孢桿菌和側孢短芽孢桿菌響應不同PH範圍的生長測定
權利要求
1.用於預防和控制蜜蜂中的細菌疾病的組合物，包含蜜蜂(Apismellifera)或其它傳粉昆蟲中分離的共生細菌。
2.權利要求1所述的組合物，其中共生細菌包括一種或兩種彼此組合的產孢子細菌，和/或可能但不必需的，與一種或多種乙酸細菌組合。
3.權利要求2所述的組合物，其中產孢子細菌選自蘇雲金芽孢桿菌(Bacillusthuringensis)和側抱短芽抱桿菌(Brevibacillus Iaterosporus)，而乙酸細菌是Saccharibacter sp. 0
4.權利要求1所述的組合物，其中疾病是蜜蜂的細菌疾病。
5.權利要求4所述的組合物，其中蜜蜂的細菌疾病是由幼蟲類芽孢桿菌(Paenibacillus larvae)或蜂房蜜蜂球菌(Melissococcus pluton)導致的。
6.權利要求1-4所述的組合物，其形式為在用於水中稀釋的粉末形式、漿、糖漿、實心棒或餅中的幹細菌生物質。
7.用於控制和預防蜜蜂的疾病的方法，包括將蜜蜂/幼蟲、蜂巢或蜂箱與有效量的組合物接觸，所述組合物包含兩種產孢子細菌，所述細菌可能但不必需的組合乙酸細菌。
8.權利要求7所述的方法，其中蜜蜂疾病是細菌疾病。
9.權利要求8所述的方法，其中細菌蜜蜂疾病是由幼蟲類芽孢桿菌或蜂房蜜蜂球菌引起的。
10.權利要求7所述的方法，其中產孢子細菌選自蘇雲金芽孢桿菌和側孢短芽孢桿菌，而乙酸細菌是Saccharibacter sp.。
11.權利要求7所述的方法，其中使用的組合物形式為在用於水中稀釋的粉末形式、漿、糖漿、實心棒或餅中的幹細菌生物質。
全文摘要
本發明涉及用於保護蜜蜂健康的益生菌混合物，更具體的涉及用於保護免受微生物病狀，例如由美國幼蟲腐臭病(AFD)的病原——幼蟲類芽孢桿菌(Paenibacillus larvae)導致的病變。
文檔編號A01P1/00GK103002745SQ201180022359
公開日2013年3月27日 申請日期2011年5月3日 優先權日2010年5月4日
發明者C·哈姆迪, D·達方切奧 申請人:米蘭大學