一種桔黴素人工抗原的製備方法
2023-05-09 22:49:41
專利名稱：一種桔黴素人工抗原的製備方法
技術領域：
本發明屬於免疫學技術領域，涉及一種桔黴素與蛋白質載體大分子偶聯製備人工抗原的方法。
背景技術：
桔黴素(citrinin，簡稱CIT)是一種真菌的次級代謝產物，自然界中多種青黴和麴黴都可以產生。它的汙染常發生在玉米、小麥等食品及飼料中，能直接或者間接進入食品鏈，威脅人或動物的健康和生命安全。CIT作用的靶器官是腎臟，毒性較明顯，能引起實驗動物的腎臟腫大、尿量增多、腎小管擴張和上皮細胞變性壞死等症狀，還可以致畸、導致腫瘤、 誘發突變，小鼠口服半數致死量LD5tl為110mg/kg。目前CIT的檢測方法主要有比色法、薄層層析法(thin layer chromatography, 簡稱 TLC)、高效液相色譜法(high performance liquid chromatography，簡稱 HPLC)和酶聯免疫吸附法(enzyme-liked immunosorbent assay，簡稱ELISA)。前兩種方法靈敏度達不到限量檢測的要求，而高效液相色譜法的前處理比較複雜、檢測費用高、費時費力。ELISA 法的靈敏度高、特異性好、前處理簡單、檢測成本低，是目前使用最多的免疫學檢測方法，且抗原和抗體是免疫分析技術的核心試劑和技術源頭。由於CIT是小分子半抗原，只具有反應原性，不具有免疫原性，因此對其進行改造，合成完全抗原是獲得抗桔黴素抗體並且建立免疫學檢測的關鍵步驟，但是目前幾乎所有關於CIT的免疫學檢測都是採用Marmich法合成CIT的完全抗原，但是此法製備CIT完全抗原存在偶聯比低、毒素利用率不高等特點。
發明內容
(一 )要解決的技術問題本發明的目的在於針對上述現有技術存在的不足而提供一種CIT-載體蛋白偶聯物的合成方法。( 二 )技術方案為達到上述目的，本發明採用的技術方案是將CIT的羥基封阻，使其羧基暴露，經N-羥基琥珀醯亞胺 (N-Hydroxysuccinimide,簡稱 NHS)和 N，N，- 二環己基碳醯亞胺(N， N' -dicyclohexylcarbodiimide，簡稱DCC)的活化，使之能與載體蛋白的氨基進行偶聯。
圖 ICIT 結構圖2CIT與載體蛋白的偶聯機理
具體實施例方式實施例18-甲氧基-桔黴素-牛血清白蛋白(8-MeO-CIT-BSA)人工抗原的製備
1. 8-甲氧基-桔黴素(8-MeO-CIT)的製備將Img CIT溶於2. 5mL無水丙酮中，在N2保護下加入等摩爾的K2CO3負載試劑和 (CH3)2S04，58°C避光回流反應他；將反應液溶液旋轉蒸發，溶於少量甲醇，用二維薄層層析， 以甲苯、乙酸乙酯、甲酸(7 3 1，ν/ν/ν)和氯仿、甲醇、正己烷(32 1 17，v/v/v)為展開劑，分離目標封阻產物8-MeO-CIT。2. 8-MeO-CIT-BSA人工抗原的製備(1)取0. 5mg 8-MeO-CIT與等摩爾NHS和DCC溶於200 μ L無水四氫呋喃，室溫震蕩反應池。所得反應液4000r/min離心15min，以無水四氫呋喃洗滌固形物2 3次，合併上清，待四氫呋喃揮發，殘留物溶於100 μ L 二甲基甲醯胺。(2)取 5mg 牛血清白蛋白(Bovine serum albumin, BSA)溶於 400 μ L 0· 13Μ 的 NaHCO3。(3)將(1)所得緩慢滴入0)，室溫振蕩反應12h。反應體系溶液中即含偶聯物 8-甲氧基-桔黴素-牛血清白蛋白(8-MeO-CIT-BSA)。(4)將(3)所得溶液置於0. 05mol/L pH 7. 4的PBS中透析2d，每間隔4h更換1 次透析液，然後再用去離子水透析ld，將透析袋中的溶液分裝，經冷凍乾燥，即得到桔黴素人工抗原 8-MeO-CIT-BSA。實施例28-甲氧基-桔黴素-卵清蛋白(8-MeO-CIT-OVA)人工抗原的製備1. 8-MeO-CIT 的製備將Img CIT溶於2. 5mL無水丙酮中，在N2保護下加入等摩爾的K2CO3負載試劑和 (CH3)2S04，58°C避光回流反應他；將反應液溶液旋轉蒸發，溶於少量甲醇，用二維薄層層析， 以甲苯、乙酸乙酯、甲酸(7 3 1，ν/ν/ν)和氯仿、甲醇、正己烷(32 1 17，v/v/v)為展開劑，分離目標封阻產物8-MeO-CIT。2. 8-Me0-CIT-0VA 人工抗原的製備(1)取0. 5mg 8-MeO-CIT與等摩爾NHS和DCC溶於200 μ 1無水四氫呋喃，室溫震蕩反應池。所得反應液4000r/min離心15min，以無水四氫呋喃洗滌固形物2 3次，合併上清，待四氫呋喃揮發，殘留物溶於100μ 1 二甲基甲醯胺。(2)取 IOmg 卵清蛋白(ovalbumin, OVA)置於 400 μ 1 0. 13Μ 的 NaHCO3，儘量將其溶解，於8000r/min高速離心lOmin，取上清。(3)將⑴所得緩慢滴入(2)中所得上清，室溫振蕩反應12h。反應體系溶液中即含人工抗原8-Me0-CIT-0VA。(4)將(3)所得溶液置於0. 05mol/L PH 7. 4的PBS中透析2d，每間隔4h更換1 次透析液，然後再用去離子水透析ld，將透析袋中的溶液分裝，經冷凍乾燥，即得到桔黴素人工抗原 8-Me0-CIT-0VA。CIT-載體蛋白偶聯物的鑑定採用紫外分光光度計對載體蛋白、CIT標品及偶聯物進行掃描，根據其特徵吸收峰來確定偶聯是否成功。結果顯示，CIT-載體蛋白偶聯物在可見光區有明顯吸收峰出現，與CIT的最大吸收峰(319nm)相比有紅移現象。根據可見分光光度法，按以下公式，可以計算出CIT與載體蛋白的偶聯比。
公式[Aconjugate 319πιιι/ ε CIT 319nm] / [ (AconjUgate 278nm_-^conjugate319niii ^ ￡ CIT278nm/ ￡ CIT319nm) / ￡ protein 278mn]Aconjugate
319nm · 偶聯物在319nm的吸光度；Aconjugate
278nm · 偶聯物在278nm的吸光度；ε CIT 319nm =CIT在319nm處的摩爾消光係數；ε CIT 278nm :CIT在278nm處的摩爾消光係數；ε protein 319nm 載體蛋白在319nm處的摩爾消光係數；ε protein 278nm 載體蛋白在278nm處的摩爾消光係數。經過計算，CIT與載體蛋白的偶聯比在6 1左右，證明成功製備了 CIT完全抗原。核心參考文獻[1]胡曉清，陳福生，刑淑婕，劉暢.紅曲中桔黴素的薄層層析分析.食品科學， 2003,2 :126-129[2]李雲，閻雪秋.紅曲與桔黴素.食品與發酵工業，2000，沈:82-86[3]劉仁榮，餘宙，何慶華，許楊.抗桔青黴素單克隆抗體的研製與鑑定.衛生研究，2007，36 :190-192[4]許贛榮，陳蘊，虞慧玲.高效液相色譜法測定紅曲莫納可林及桔黴素-如何防治色素的幹擾.食品與發酵工業，2002，10 59-60[5]黃祖新，林應椿，鄭廣樂，林輝煌.HPLC法測定福建紅曲中的桔黴素.福建師範大學學報，2003，19 37-39[6]Abramson D,Usleber E,Martlbauer Ε. An indirect enzyme immunoassay for the mycotoxincitrinin. App1. Environ. Microbiol,1995,61(5) :2007-2009[7]Abramson, D. , Usleber, Ε. , Martlbauere, Ε. ,1996. Determination of citrinin in barley by indirectand direct enzyme immunoassay. Journal of AOAC International. 79，1325-1329[8]Abramson, D. , Usleber, Ε. , Martlbauere, Ε. , 1999. Rapid determination of citrinin in corn byfluorescence liquid chromatography and enzyme immunoassay. Journal of AOACInternational. 82,1353—1356[9]Bao-junXu, Xiao-qinjia, Li-juanGu, Chang-keunSung.Review on the qualitative and quantitativeanalysis of the mycotoxin citrinin. food control, 2006,17(4) :271-285[10]Duan,Z. H.，Lin，Z. S.，Yao，H. R.，Gao，Y. H. ,Zhang, K. ,Zhao, S. Q.，Zhu，Z. Y.， 2009. Preparation ofArtificial Antigen and Egg Yolk-derived Immunoglobulin(IgY) of Citrinin for Enzyme-LinkedImmunosorbent Assay. Biomedical and Environmental Sciences. 22,237-243[ll]Meister, U. New method of citrinin determination by HPLC after polyamide column clean-up. European Food Research and Technology,2004,218 (1) 394-399[12]Rasheva, Τ. V. , Nedeva, T S, et al. Characterization of a non-pigmentproducing Μ. purpureusmutant strain. Applied and Environmental Microbiology, 2003,83(3) :333-340
權利要求
1.一種桔黴素(citrinin，簡稱CIT)人工抗原的製備方法，其特徵在於首先用硫酸二甲酯封阻桔黴素分子的羥基，減少CIT分子內氫鍵的形成，使其羧基暴露，然後利用活性酯法的原理以N-羥基琥珀醯亞胺(N-Hydroxysuccinimide，簡稱NHS)和N，N，-二環己基碳醯亞胺(N，N' -dicyclohexylcarbodiimide，簡稱DCC)將其活化，與載體蛋白質的氨基相連，最後通過透析、冷凍乾燥即得到桔黴素人工抗原。
2.按權利要求1所述的CIT人工抗原的製備方法，其特徵在於所述的硫酸二甲酯封阻 CIT羥基的過程為將Img CIT溶於2. 5mL無水丙酮中，在N2保護下加入等摩爾的K2CO3負載試劑和(CH3)2S04，58°C避光回流反應他；將反應液溶液旋轉蒸發，溶於少量甲醇，用二維薄層層析，以甲苯、乙酸乙酯、甲酸(7 3 1，ν/ν/ν)和氯仿、甲醇、正己烷(32 1 17， ν/ν/ν)為展開劑，分離目標封阻產物8-甲氧基-桔黴素(8-MeO-CIT)。
3.按權利要求1或2所述的CIT人工抗原8-甲氧基桔黴素-牛血清白蛋白 (8-MeO-CIT-BSA)的製備方法，其特徵在於所述的CIT封阻產物在兩相體系中與載體蛋白質的氨基相連過程為(1)取0.5mg 8-MeO-CIT與等摩爾的NHS和DCC溶於200 μ L無水四氫呋喃，室溫震蕩反應池。所得反應液4000r/min離心15min，以無水四氫呋喃洗滌固形物2 3次，合併上清，待四氫呋喃揮發，殘留物溶於IOOyL 二甲基甲醯胺；(2)取5mg 牛血清白蛋白(Bovine serum albumin,BSA)溶於 400 μ L 0. 13Μ 的 NaHCO3 ；(3)將(1)所得緩慢滴入0)，室溫振蕩反應12h。反應體系溶液中即含桔黴素完全抗原 8-MeO-CIT-BSA。
4.按權利要求1或2所述的CIT人工抗原8-甲氧基桔黴素-卵清蛋白 (8-MeO-CIT-OVA)的製備方法，其特徵在於所述的CIT封阻產物在兩相體系中與載體蛋白質的氨基相連過程為(1)取0.5mg 8-MeO-CIT與等摩爾的NHS和DCC溶於200 μ L無水四氫呋喃，室溫震蕩反應池。所得反應液4000r/min離心15min，以無水四氫呋喃洗滌固形物2 3次，合併上清，待四氫呋喃揮發，殘留物溶於IOOyL 二甲基甲醯胺；(2)取IOmg卵清蛋白(ovalbumin,OVA)置於400 μ L 0. 13Μ的NaHC03，儘量將其溶解， 於8000r/min高速離心lOmin，取上清；(3)將⑴所得緩慢滴入(2)中所得上清，室溫振蕩反應12h。反應體系溶液中即含桔黴素完全抗原偶聯物8-MeO-CIT-OVA。
5.按權利要求1或3所述的桔黴素(citrinin，簡稱CIT)人工抗原的製備方法，其特徵在於所述的透析、冷凍乾燥過程為將最終保留的含偶聯物的溶液密閉於透析袋中， 在0. 05mol/LpH 7. 4的PBS中透析2d，每間隔4h更換1次透析液，然後再用去離子水透析ld，將透析袋中的溶液分裝，經冷凍乾燥，即得到桔黴素人工抗原8-MeO-CIT-BSA或者 8-Me0-CIT-0VA。
全文摘要
本發明涉及一種桔黴素人工抗原的製備方法。該方法根據甲基化反應的原理，先將桔黴素結構中的羥基封阻，減少桔黴素分子內氫鍵的形成，使其羧基充分暴露，然後利用活性酯法的原理以N-羥基琥珀醯亞胺和N，N』-二環己基碳醯亞胺將其活化，與載體蛋白質的氨基相連，最後通過透析、冷凍乾燥即得到桔黴素人工抗原。本發明有益效果是1.能夠有效的製備出桔黴素人工抗原，提高偶聯物的偶聯比；2.提高桔黴素的利用率；3.本方法製備的桔黴素人工抗原具有很好的穩定性。
文檔編號G01N21/31GK102329389SQ20101022434
公開日2012年1月25日 申請日期2010年7月13日 優先權日2010年7月13日
發明者劉愛平, 王小紅, 陳福生 申請人:劉愛平, 王小紅, 陳福生