可利黴素的純化工藝的製作方法
2023-05-09 23:34:36
專利名稱：可利黴素的純化工藝的製作方法
可利黴素的純化工藝
技術領域：
本發明涉及醫藥化工技術領域，更具體地講，涉及一種從發酵液中提取可利黴素 的純化工藝。
背景技術：
可利黴素，又稱必特螺旋黴素，是中國第一個抗生素一類新藥。它是由轉基因的螺 旋黴素產生菌發酵得到的，在螺旋黴素4"位加入異戊醯基側鏈形成的多種結構類似成分 的混合物。其成品的主要組分為異戊醯螺旋黴素I、II、III，除此以外還含有少量丁醯、丙 醯、乙醯螺旋黴素Π、ΙΙΙ等醯化螺旋黴素，化學結構如下圖，具體組分見表1。成品組分要 求為異戊醯螺旋黴素III含量不低於30%，總異戊醯螺旋黴素含量不低於65%，總醯化螺 旋黴素含量不低於80%。可利黴素成分複雜，用溶媒萃取法從發酵液中提取獲得的萃取液由於含有過多乙 醯、丙醯螺旋黴素而使最終獲得的成品不能達到組分指標要求。因此，在溶媒萃取法的基礎 上建立合理有效的分離純化工藝，去除雜質，優化組分配比，是提高可利黴素產品質量的有 效方法。可利黴素化學結構式示意圖如圖3所示。目前，對大環內酯類抗生素的提取分離研究主要集中於對溶媒萃取法、大孔樹脂 吸附法等工藝的研究。例如，中國發明專利CN1228437A公開了一種從發酵濾液中提取螺旋 黴素的工藝，通過改進傳統工藝和設備，簡化操作，提高收率。但針對去除雜質、優化組分而 進行的研究還較少，尤其是可利黴素作為一類新藥，對其組分純化研究的報導更少。表1可利黴素組分一覽表
螺旋黴素II 乙醯螺旋黴素II
螺旋黴素III 乙醯螺旋黴素III 丙醯螺旋黴素III (異)丁醯螺旋黴素II 異戊醯螺旋黴素I 異戊醯螺旋黴素II 異戊醯螺旋黴素III
發明內容本發明所要解決的技術問題是，提供一種通過緩衝鹽溶液洗滌溶劑萃取相、分離 雜質、優化組分的純化方法。為了解決上述問題，本發明提供了一種提取可利黴素的純化工藝，包括如下步驟(1)向發酵液中加入絮凝劑沉澱蛋白，過濾獲得濾液，其中，所述絮凝劑加入量的 質量約為發酵液質量的3% 6% ；(2)用溶媒萃取法從步驟(1)獲得的發酵濾液中提取可利黴素，取得酯相，所述溶 媒萃取法包括向濾液中加入乙酸丁酯，濾液與乙酸丁酯的體積比為10 30 1，充分攪 拌，加入NaOH溶液調節pH至8. 0 8. 8，靜置；(3)用鹽溶液、純水交替洗滌步驟(2)獲得的酯相；(4)用反萃取法將可利黴素從酯相反萃取到水相；(5)將步驟(4)得到的水相可利黴素結晶、乾燥，獲得成品。步驟(1)所述的絮凝劑為聚合氯化鋁或者聚丙烯醯胺。步驟(2)所述的溶媒萃取法中，在酯相中加入破乳劑消除萃取時的乳化現象，乳 化現象不嚴重時也可不使用破乳劑；所述破乳劑是指NaCl或者十二烷基三甲基氯化銨1231。步驟(3)所述的洗滌過程包括先用純水洗滌，再用鹽溶液洗滌，最後再用純水洗 滌；所述洗滌過程包括(1)用純水洗滌，酯與純水的體積比為3 5 1 ；(2)用鹽溶液洗滌，酯與鹽溶液的體積比為3 5 1 ；(3)用純水洗滌，酯與純水的體積比為3 5 1。步驟(3)所述的鹽溶液為pH4 7的緩衝溶液；所述的鹽溶液為磷酸鹽緩衝液體系或者醋酸鹽緩衝液體系；鹽溶液質量濃度為 0. 4% ；所述的鹽溶液為質量濃度為0. 4% 的NaH2PO4溶液時最優。本發明的優點在於，該純化方法操作簡單，通過萃取，尤其是步驟(3)緩衝鹽溶液 的選擇性作用，酯相提取液中去除了大部分螺旋黴素等雜質，使主要組分達到優化，最終成 品中異戊醯螺旋黴素III、總異戊醯螺旋黴素及總螺旋黴素含量高於質量控制指標，而洗滌 液中的螺旋黴素可以分離回收，本發明大大提高了產品的質量和收率。
圖1為產品HPLC組分分析圖；圖2為產品HPLC組分分析圖。 圖3為可利黴素化學結構式示意圖。
具體實施方式
下面結合附圖對本發明提供的具體實施方式
做詳細說明。實施例1向25L可利黴素發酵液(效價796u/ml)中加入150g聚合氯化鋁，板框過濾，獲得37.5L濾液。向濾液中加入乙酸丁酯1.46L，攪拌的同時加入6mol/LNa0H溶液調節pH至 8. 5，繼續攪拌30min後靜置，加NaCl後分層獲得1. 13L酯相提取液。依次用280mL水、質量 濃度為的NaH2PO4溶液、水對丁酯提取液進行洗滌。向洗後體積為1. 07L的丁酯提取液 中加入純水310mL，攪拌的同時加入3mol/L鹽酸溶液調節pH至2. 1，繼續攪拌30min後靜 置、分層，獲得325ml水相提取液。加入2mol/L NaOH溶液調節pH至中性，通入N2吹氣5h。 向獲得的300ml水相提取液中加入2mol/L NaOH溶液調節pH至10. 0，靜置、抽濾、乾燥，獲 得可利黴素成品8. 6g。經檢測，成品中異戊醯螺旋黴素III含量為32.9%，總異戊醯螺旋黴素含量為 75. 9%，總螺旋黴素含量為91. 8%，產品總收率為45. 9%。產品HPLC組分分析圖見圖1，其 中每個峰號代表的物質與表一中的組分對應。實施例2向25L可利黴素發酵液(效價1470u/ml)中加入125g聚合氯化鋁，用板框過濾， 獲得40L濾液。向濾液中加入乙酸丁酯3. 5L，攪拌的同時加入6mol/LNa0H溶液調節pH至 8. 2，繼續攪拌30min後靜置，分層獲得2. 98L酯相提取液。用745ml水對酯相提取液進行一 次洗滌，再用745ml質量濃度為0. 7%的NaH2PO4溶液對酯相提取液進行兩次洗滌。向洗後 體積為2. 86L的提取液中加入質量濃度為0. 7%的NaH2PO4溶液1L，攪拌的同時加入3mol/L 鹽酸溶液調節PH至2. 2，繼續攪拌30min後靜置、分層，獲得1. 04L水相提取液。加入2mol/ L NaOH溶液調節pH至中性，通入N2吹氣5h。向獲得的1. 18L提取液中加入2mol/L NaOH 溶液調節PH至9. 8，靜置、抽濾、乾燥，獲得可利黴素成品19. 7g。經檢測，成品中異戊醯螺旋黴素III含量為39.6%，總異戊醯螺旋黴素含量為 81. 0%，總螺旋黴素含量為96. 9%，產品總收率為40. 1%。產品HPLC組分分析圖見圖2， 其中每個峰號代表的物質與表一中的組分對應。以上所述僅是本發明的優選實施方式，應當指出，對於本技術領域的普通技術人 員，在不脫離本發明原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應視為 本發明的保護範圍。
權利要求
一種可利黴素的純化工藝，其特徵在於，包括如下步驟(1)向發酵液中加入絮凝劑沉澱蛋白，過濾獲得濾液，其中，所述絮凝劑質量為發酵液的3％～6％；(2)用溶媒萃取法從步驟(1)獲得的發酵濾液中提取可利黴素，取得酯相，所述溶媒萃取法包括向濾液中加入乙酸丁酯，濾液與乙酸丁酯的體積比為10～30∶1，充分攪拌，加入NaOH溶液調節pH至8.0～8.8，靜置；(3)用鹽溶液、純水交替洗滌步驟(2)獲得的酯相；(4)用反萃取法將可利黴素從酯相反萃取到水相；(5)將步驟(4)得到的水相可利黴素結晶、乾燥，獲得成品。
2.根據權利要求1所述的可利黴素的純化工藝，其特徵在於，步驟(1)所述的絮凝劑為 聚合氯化鋁或者聚丙烯醯胺。
3.根據權利要求1所述的可利黴素的純化工藝，其特徵在於，步驟(2)所述的溶媒萃取 法中，在酯相中加入破乳劑消除萃取時的乳化現象。
4.根據權利要求3所述的可利黴素的純化工藝，其特徵在於，所述破乳劑是指NaCl或 者十二烷基三甲基氯化銨1231。
5.根據權利要求1所述的可利黴素的純化工藝，其特徵在於，步驟(3)所述的洗滌過程 包括先用純水洗滌，再用鹽溶液洗滌，最後再用純水洗滌。
6.根據權利要求5所述的可利黴素的純化工藝，其特徵在於，所述洗滌過程包括(1)用純水洗滌，酯與純水的體積比為3 5 1 ；(2)用鹽溶液洗滌，酯與鹽溶液的體積比為3 5 1 ；(3)用純水洗滌，酯與純水的體積比為3 5 1。
7.根據權利要求1所述的可利黴素的純化工藝，其特徵在於，步驟(3)所述的鹽溶液是 PH為4 7的緩衝溶液。
8.根據權利要求7所述的可利黴素的純化工藝，其特徵在於，所述的鹽溶液為磷酸鹽 緩衝液體系或者醋酸鹽緩衝液體系。
9.根據權利要求7所述的可利黴素的純化工藝，其特徵在於，所述的鹽溶液質量濃度 為 0. 4% 1%。
10.根據權利要求7所述的可利黴素的純化工藝，其特徵在於，所述的鹽溶液為質量濃 度為0. 4% 1 %的NaH2PO4溶液。
全文摘要
本發明公開了一種從發酵液提取可利黴素的純化工藝，包括如下步驟(1)向發酵液中加入絮凝劑沉澱蛋白，過濾獲得濾液；(2)用溶媒萃取法從步驟(1)獲得的發酵濾液中提取可利黴素，取得酯相；(3)用鹽溶液、純水交替洗滌步驟(2)獲得的酯相；(4)用反萃取法將可利黴素從酯相反萃取到水相；(5)將步驟(4)得到的水相可利黴素結晶、乾燥，獲得成品。該純化方法通過萃取，尤其是通過緩衝鹽溶液洗滌萃取相，去除了其中殘留的螺旋黴素，優化了可利黴素的組分配比，所得產品符合質量指標要求，而洗滌液中的螺旋黴素可以分離回收，大大提高了產品的質量和收率。
文檔編號C07H1/06GK101921302SQ201010229139
公開日2010年12月22日 申請日期2010年7月16日 優先權日2010年7月16日
發明者吳豔陽, 張海平, 朱家文, 武斌, 遊旭, 紀利俊, 郝玉有, 陳葵, 顧芨芨 申請人:華東理工大學;上海同聯製藥有限公司