L-穀氨酸氧化酶及該酶催化生產α-酮戊二酸的製作方法

2023-05-25 14:56:31 3

專利名稱：L-穀氨酸氧化酶及該酶催化生產α-酮戊二酸的製作方法
技術領域：
本發明涉及微生物酶法一步轉化L-穀氨酸生成a -酮戊二酸生產方法，屬於催化法生產精細化學品領域。
背景技術：
a-酮戊二酸(a-ketoglutarate，a-KG)，又稱a -膠酮酸，2_氧代戊二酸或a -羰基戊二酸，分子式為C5H6O5，相對分子量為146. 1，a -KG為白色或類白色結晶或結晶性粉末，無色，易溶於水，在微生物細胞的代謝中起著重要的作用，是三羧酸循環(TCA)的重要中間產物之一，在生物體內參與胺基酸、蛋白質、維生素的合成以及能量代謝。a -KG在各個領域有著重要的應用前景，作為一種營養強化劑，廣泛應用於食品、醫藥、有機合成、化妝品和飼料等工業中。微生物催化是通過微生物整體細胞或酶將複雜的底物進行結構修飾，本質就是利用生物代謝過程中產生的某個或某一系列的酶將一種物質(底物)轉化成另一種物質(產物)的過程。微生物催化法有以下優勢(I)環境友好型。由於酶催化反應條件比較溫和，通常在常溫、常壓、pH值近中性的條件下進行，可減少或避免強酸、強鹼或有毒物質的使用，從而減輕對環境的汙染。(2)轉化率高。通過對用於某一轉化的微生物進行菌種選育和轉化條件的優化，可以得到極高的轉化率。(3)微生物生物量積累快，產生的酶量也相應多，轉化時間短，能夠提高生產效率。(4)集團專一性強，不需要對集團進行保護，所形成的副產物 少，手性和旋光性好。L-穀氨酸氧化酶首先由Hitoshi Kusakabe等人在鏈黴菌x_119_6中發現,該酶在反應過程中不需要外來因素，它是一種胞外酶，可以氧化L-穀氨酸生產a -KG,研究還表明，該酶具有很高的底物專一性，氧化ImoL L-穀氨酸需要ImoL O2和ImoL和H2O,生成ImoL a -KG> ImoL NH^PlmoL H2O2。1989年,Annette Buhmer等內塗鏈黴菌以可溶性澱粉、甘油、酵母提取物、無機鹽等為培養基，發酵後用硫酸銨沉澱，葡聚糖凝膠等方法，將酶提純。之後，臺灣的Chen chien-yuan等人用普拉特鏈黴菌NTU3304也成功地提純了 L-穀氨酸氧化酶，並應用於傳感器中。1993年，華東化工學院生化工程研究所的徐水清和李友榮，用鏈黴菌p-26，經L-穀氨酸誘導培養能形成胞外L-穀氨酸氧化酶，其粗酶液活力大約為0. 2U/
mLo隨著a-KG應用範圍不斷擴大，市場需求也在不斷增長。目前工業化生產採用的是有機合成法，涉及一系列複雜的化學反應過程，從而引起原料來源、環境汙染等方面一系列問題。目前國內外利用生物催化法生產a-KG還未見有報導。

發明內容
本發明的目的是提供一種利用生物酶工程技術製備a -酮戊二酸的方法。為實現上述目的，本發明採用了以下技術方案一種生物酶催化生產a-酮戊二酸的方法，將一定濃度的穀氨酸鈉水溶液加入含有L-穀氨酸氧化酶的發酵液中，並在通空氣條件下30°C反應12h，經分離得到a-酮戊二酸。本發明的反應方程式如下
L-穀氨酸+02+H20 1■令氧醇鄉％ OC-酮戊二酸+NH3^2O2由上述技術方案可知，本發明採用的是生物酶工程技術，利用L-穀氨酸鈉一步催化生成a-酮戊二酸，所用原料為廉價的L-穀氨酸鈉，俗稱味精。由此可見，本發明生產工藝簡單，生產成本低，且生產過程中沒有環境汙染。
本發明的技術方案本發明涉及了一種生物酶法催化L-穀氨酸鈉生產a-酮戊二酸的方法，在添加20g/L的L-穀氨酸鈉的條件下轉化12h生成14. 5g/L的a -酮戊二酸，轉化率達到0. 84mol/molo1、L-穀氨酸氧化酶的酶學性質由本發明的方程式可知，本反應所需的L-穀氨酸氧化酶，該酶由鏈黴菌(Streptomyces ghanaensis FMME067)生產，一般發酵 48 72h,—般情況下發酵 60h 可用於本發明。該酶具有底物專一性，可專一性的轉化L-穀氨酸、L-穀氨酸鈉和穀氨醯胺；該酶在80°C下存放Ih會完全失去轉化能力，28°C下存放3d，酶轉化能力在90%以上，含酶的發酵液在4°C下存放10d，酶的轉化能力在90%以上；Km值為0. llmol/L。2、L-穀氨酸鈉轉化生產a -酮戊二酸的工藝本發明利用含有L-穀氨酸氧化酶的發酵液生產a-酮戊二酸，底物可為L-穀氨酸和L-穀氨酸鈉，由於L-穀氨酸在水溶液中溶解度低，價格比L-穀氨酸鈉昂貴，作為本發明的優選方案，以L-穀氨酸鈉作為轉化底物，食品級含量> 99%，這種情況下，可以減少後續操作難度。L-穀氨酸鈉底物濃度可控制在10 30g/L，為提高底物的轉化率、節約原料底物L-穀氨酸鈉以及後期分離提取的成本，作為本發明的優選方案，L-穀氨酸鈉添加量為20g/L，這樣既不會影響轉化率，也不會浪費底物。含有L-穀氨酸氧化酶的發酵液轉化pH控制在7. 5 9. 5。作為本發明的優選方案，pH控制在8. 5，這樣pH8. 5既接近於發酵液pH，又可以保證較高的轉化率。底物L-穀氨酸鈉溶液和發酵液混合後在通氣條件下28 37°C時反應12h，既可以停止轉化分離提取a -酮戊二酸，作為本發明的優選方案，反應溫度為30°C，L-穀氨酸氧化酶在該溫度下保持最高的轉化活力，轉化率最高。L-穀氨酸氧化酶主要存在於胞內，發酵液中也有少量一部分，為充分利用該酶，提高轉化能力，可以改變細胞膜通透性，方法有酶法，凍融及研磨法，化學法；由於酶法成本較高；物理法雖然效果價高，無毒無害，但是放大以及工業化中有一定的難度；化學法中常用甲苯、乙醇、異丙醇，其中以異丙醇效果最好，並且沸點較低，有利於後期操作，作為本發明的優選方案，添加5%異丙醇(v/v)。a -酮戊二酸含量測定方法採用高效液相色譜法，HPLC條件Therm0 UltiMate3000system、Aminex HPX-87H 色譜柱、流動相5mmol/L 稀硫酸、流速0. 6mL/min ;柱溫350C :進樣量20 u L ;紫外檢測器，波長210nm。


圖1色譜檢測結果，0.5g/L a-酮戊二酸標準樣品。圖2色譜檢測結果，轉化12h發酵液中a -酮戊二酸含量。圖3Km值測定結果。
具體實施例方式1、L-穀氨酸氧化酶底物特異性實驗根據Trinder反應,用pH7. 0的磷酸鹽緩衝液配製濃度llmg/mL的L型胺基酸溶液進行顯色反應測定，30°C準確反應30min後，100°C下煮沸5min,在550nm下進行測定。
權利要求
1.L-穀氨酸氧化酶，該酶由鏈黴菌生產，一般發酵48 72h，該酶具有底物專一性，在室溫下可存放2 4d，4°C下可存放7 10d，該酶轉化能力保持在90%以上。
2.酶法轉化生產a-酮戊二酸工藝，將L-穀氨酸鈉添加到含有L-穀氨酸氧化酶的發酵液進行轉化，pH可控制在7. 5 9. 5。
3.根據權利要求2所述，轉化過程中，L-穀氨酸鈉底物濃度可控制在10 30g/L。
4.根據權利要求2、3所述，以L-穀氨酸鈉作為底物，添加到含酶發酵液中進行轉化，轉化溫度可控制在28 37°C，轉化12 16h。
5.根據權利要求2、3、4所述，為提高轉化能力，可以改變細胞膜通透性，方法有酶法，凍融及研磨法，化學法；由於酶法成本較高；物理法雖然效果價高，無毒無害，但是放大以及工業化中有一定的難度；化學法中常用甲苯、乙醇、異丙醇，並且沸點較低，有利於後期操作。
全文摘要
本發明闡述了一種具有底物特異性的L-穀氨酸氧化酶以及該酶催化生產α-酮戊二酸，屬於酶法催化生產精細化學品領域。本發明是利用一種只對L-穀氨酸、L-穀氨酸鈉及穀氨醯胺具有底物專一性的L-穀氨酸氧化酶，在發酵60h的含L-穀氨酸氧化酶的發酵液中，添加20g/L的L-穀氨酸鈉溶液，在通氣條件下，30℃，pH8.5，添加5％(v/v)異丙醇條件下轉化12h，通過高效液相色譜法測得α-酮戊二酸含量達到14.5g/L。
文檔編號C12P7/50GK102994467SQ20121056367
公開日2013年3月27日 申請日期2012年12月24日 優先權日2012年12月24日
發明者劉立明, 牛盼清, 林小寶 申請人:江南大學