結締組織生長因子c區抗原的製備方法
2023-05-24 21:11:46 1
專利名稱：結締組織生長因子c區抗原的製備方法
技術領域：
本發明涉及一種結締組織生長因子C區抗原的製備方法。
二.
背景技術：
CTGF是高度保守的CCN多肽家族(CTGF，CYR61，Nov)成員之一，該蛋白為肝素結合型，含349個胺基酸，富含半胱氨酸，其38個保守的半胱氨酸殘基分成兩個節段，其中22個在N末端區，16個在C末端區，蛋白結構主要分為4個區為胰島素樣生長因子結合蛋白區，von Willebrand因子C型重複區，血小板反應蛋白(thrombospondin)1型重複區以及生長因子半胱氨酸群，Mr38000，主要由成纖維細胞，平滑肌細胞和內皮細胞合成分泌，成年哺乳動物心，腦，腎，肺，肝以及胎盤中均有表達。
國外有報導，將CTGF基因克隆入pcDNA3.1載體，在哺乳動物細胞內表達，純化目的蛋白後作為抗原免疫動物獲得抗體。由於CTGF蛋白有4個功能區，前3個功能區與血清內其它細胞因子有共同抗原，用CTGF蛋白全序列作為抗原免疫動物獲得的抗體，將會與血清中其它細胞因子發生交叉反應，測定結果可能為假陽性，給臨床診斷帶來錯誤判斷，因此選用CTGF特異的C區作抗原獲得的抗體只爭對CTGF發生抗原-抗體反應，而不與其它細胞因子發生反應，具有高度的選擇性，消除了由於交叉反應導致的假陽性結果。因此製備CTGF特異的C區抗原具有十分重要的意義。
三、技術內容本發明提供一種能夠提高體內外蛋白分子穩定性並能增強免疫活性的結締組織生長因子C區抗原的製備方法。
本發明採用如下技術方案來解決其技術問題本發明即一種結締組織生長因子抗原的製備方法，第一步用NheI和XbaI酶對pCOMB3載體進行雙酶切，切除兩酶切位點NheI和XbaI之間的272bp條帶後的載體用T4 DNA連接酶自連後轉化大腸桿菌JM109，然後，以質粒pET-28(a)+作模板，分別以p15』-GGCTCGAGGCCAACTCTAGTATGGCCC-3』及p25』-GGACTAGTCTAACCAGCACTTCAGTGGGAA-3』為上、下遊引物，PCR擴增後，可見550bp條帶的擴增產物，回收該條帶，並將回收的條帶與被切除272bp後的pCOMB3載體連接，經轉化JM109後篩選得到陽性質粒pKM；第二步用組織貼壁法進行人內皮細胞原代培養，用50mmol/L葡萄糖修飾的牛血清白蛋白對原代培養後的內皮細胞幹預8h，0.125％胰蛋白酶消化後，用Trizol法提取RNA，用逆轉錄試劑盒合成cDNA，在1.5ml管中依次加入雙蒸H2O 31.5μl，10×Taq buffer 5μl，10mol/L dNTP 1μl，濃度為25pmol/μl的引物p35』-CCCGGATCCGAAGCGGACCTAGAG-3』1μl，p45』-CCCAAGCTTTGCCATGTCTCCGTG-3』1μl，濃度為0.65μg/μl的cDNA模板10μl，濃度為5U/μl的TaqPlus聚合酶0.5μl，置於PCR儀擴增，擴增條件94℃ 5min變性，94℃ 1min，65℃ 30sec，72℃ 1min，35個循環，72℃延伸10min，4℃保溫，再用SpeI和XhoI酶對PCR產物與陽性質粒pKM分別進行雙酶切後，用T4DNA連接酶使兩個片段通過粘性末端相連，轉化大腸桿菌JM109，從中獲得陽性質粒pKMc1；編碼結締組織生長因子C區242-349位胺基酸的核苷酸序列第三步將含陽性質粒pKMc1的大腸桿菌JM109單菌落擴增後，用異丙基-β-D-硫代半乳糖苷37℃誘導3h，得到含有結締組織生長因子C區242-349位胺基酸的大腸桿菌，超聲破碎細胞，用鎳離子樹脂親和層析獲得結締組織生長因子抗原。
與現有技術相比，本發明具有以下有益效果本發明從血管內皮細胞中提取總RNA，逆轉錄合成cDNA。設計特異性引物，擴增CTGF C區242-349基因，插入噬菌體包膜蛋白基因III的上遊，兩個基因用GGT GGC GGT GGC TCT相連，在啟動子LacZ的作用下，翻譯成CTGF-GGGGS-pIII的融合蛋白。該融合蛋白在引導肽的作用下，定位於細胞周質並自動摺疊成具有免疫活性的蛋白分子。
a.用DNA重組技術將結締組織生長因子C區抗原與絲狀噬菌體III基因蛋白通過GGGGS柔性連接肽相連，在啟動子LacZ的作用下翻譯成結締組織生長因子-GGGGS-pIII的融合蛋白。該融合蛋白在引導肽的作用下，定位於細胞周質並自動摺疊成具有免疫活性的蛋白分子，避免胞漿內蛋白酶的切割。
b.由於pIII蛋白片段是噬菌體包膜蛋白成分，對於人體來說是一種異源蛋白，與人體血清或血漿成分無交叉反應，因此可以作為標準品或質控品不影響結果，同時可在體外顯著增加抗原的穩定性。
c.該融合蛋白由於含有噬菌體包膜蛋白成分，因此作為異種抗原免疫動物，對於製備分子量小於20000的CTGF C區的抗體時，該片段是一種較好的免疫增強劑。
d.與真核表達載體相比原核表達載體具有較高的產量。
四
圖1是本發明陽性質粒pKMc1圖。
五、具體實施方案1融合表達載體的構建1.1 pCOMB3第二個克隆位點的切除用NheI+XbaI對購於美國SCRIPPS研究所的pCOMB3進行雙酶切，可見272bp條帶，切除上述片段後，將切除272bp條帶後的剩餘大片段回收，並用T4DNA連接酶自連後轉化大腸桿菌JM109，擴增後抽提質粒，分別用NheI，XbaI，SpeI，XhoI及XhoI+SpeI酶切鑑定，結果顯示XbaI，NheI無酶切，SpeI，XhoI可見單酶切條帶，酶切位點正確；1.2片段插入及鑑定以購於美國NOVAGEN公司的pET-28(a)+作模板，p15』-GGCTCGAGGCCAACTCTAGTATGGCCC-3』，p25』-GGACTAGTCTAACCAGCACTICAGTGGGAA-3，為上、下遊引物，PCR擴增後，可見550bp條帶，回收片段後與相同酶切的切除272bp的pCOMB3連接，轉化JM109後篩選陽性質粒，1.5％瓊脂糖電泳條帶出現在空載體之後，隨機挑選10個單菌落進行PCR檢查，其中9個出現550bp條帶，陽性率90％。SpeI+XhoI雙酶切檢查，可見550bp及3800bp條帶。質粒送生工測序，結果與預期序列一致，測序結果正確的質粒命名為pKM；2結締組織生長因子(CTGF)C區基因的克隆2.1人內皮細胞培養及總RNA的提取用組織貼壁法進行人內皮細胞原代培養，含20％小牛血清的DMEM傳代後，用50mmol/L葡萄糖修飾的AGF-BSA幹預8h，0.125％胰蛋白酶消化後加5mlTrizol試劑，用26號針頭抽吸2次，室溫5min，加1ml氯仿激烈震蕩15s，4℃10000r/min離心10min，棄上清，沉澱用75％乙醇洗滌，12000r/min離心15min，棄上清，室溫乾燥5～10min，用DEPC處理的雙蒸水溶解，-70℃保存。取適量稀釋後測定OD260與OD280的比值，計算RNA濃度(OD260×稀釋倍數×40μg)為0.65μg/μl，取5μl用1.2％瓊脂糖電泳，結果顯示RNA完整；2.2 cDNA第一鏈的合成RNA20μl(13μg)加2μl Oligo(dT)18primer，混勻3～5s，70℃ 5min，冰浴冷卻5min，以次加入5×M-Mulv buffer 4μl，10mmol/L dNTP 2μl，核酶抑制劑(5U/μl)1μl，37℃ 5min，加M-Mulv 1μl(100U/μl)，37℃反應60min，最後70℃10min滅活，-20℃保存；2.3結締組織生長因子C區基因的擴增在Eppendorf管中以次加入dd H2O 31.5μl，10×Taq buffer 5μl，10mol/LdNTP 1μl，p3(25pmol/μl)5』-CCCGGATCCGAAGCGGACCTAGAG-3』1μl，p4(25pmol/μl)5』-CCCAAGCTTTGCCATGTCTCCGTG-3』1μl，cDNA第一鏈(6.5μg)10μl，TaqPlus(5U/μl)0.5μl，最後加一滴礦物油，置於PCR儀。擴增條件94℃5min變性，94℃1min ，65℃30sec，72℃1min，35個循環，72℃延伸10min ，4℃保溫。產物用1.2％瓊脂糖電泳檢查，結果顯示在350bp處有特異擴增條帶。
3陽性質粒-結締組織生長因子(pKM-CTGF)表達載體的構建及鑑定PCR產物與載體pKM經SpeI+XhoI雙酶切，回收相應片段，用T4連接酶使兩個片段通過粘性末端相連，轉化JM109。隨機挑取8個轉化子擴增後抽提質粒，分別用PCR及SpeI+XhoI雙酶切等方法作鑑定。其中有1個克隆出現350bp條帶，酶切鑑定出現3800bp及350bp兩條帶。陽性質粒測序結果與預期序列一致。該質粒命名為陽性質粒pKMc1(圖1)。
4結締組織生長因子CTGF融合蛋白的表達及純化挑取含pKMc1質粒的JM109單菌落接種400ml含Amp(50mg/L)的LB中，37℃振搖至OD600為0.5，加IPTG至終濃度1mmol/L，37℃誘導3h。分裝50ml離心管，5000r/min，離心15min，棄上清，加入20mlNTA-0 Buffer及1mmol/LPMSF，4mg溶菌酶，混勻使細胞懸浮，冰上放置30min，超聲破碎細胞。加入2ml Triton X-100，充分混勻，冰上放置15min，繼續超聲破碎細胞至粘稠度下降。加入1mmol/L MgCl2及200μg DNase混勻，室溫放置10min，15000r/min4℃離心15min，取上清，置於-20℃保存。
將NTA Resin裝入2×5cm玻璃柱中，用10倍體積NTA-0 Buffer平衡，將樣品加入柱中，流速控制在15ml/h左右，用5倍體積的NTA-0 Buffer洗滌，流速控制在30ml/h左右。然後分別用NTA-20 Buffer，NTA-40 Buffer，NTA-60Buffer，NTA-80 Buffer，NTA-100 Buffer，NTA-200 Buffer，NTA-1000 Buffer洗脫，流速控制在15ml/h左右，收集洗脫峰，每管收集一個NTA體積。紫外檢測蛋白分布情況，並用SDS/PAGE鑑定蛋白純度。結果顯示在35ku處出現很濃的蛋白條帶，與預期分子量一致，而pKM及JM109在相應位置未出現條帶，掃描分析該條帶佔菌體總蛋白的40.3％，樣品經NTA Resin純化後呈現單條帶。
5結締組織生長因子CTGF融合蛋白免疫活性測定將純化後的CTGF融合蛋白按250ng/孔包被96孔板，以含pKM的JM109菌體蛋白作陰性對照，4℃過夜。含20％小牛血清PBS 37℃封閉2h，PBST洗滌5次，每孔加CTGF單抗(1μg/ml)100μl，37℃1h，PBST洗滌5次，每孔加HRP標記的羊抗鼠二抗100μl，37℃1h，PBST洗滌5次後加TMB顯色劑100μl，室溫反應20min，加1mol/L HCl終止反應，在全自動酶標儀上掃描測定在λ＝450nm時的吸光度值。結果顯示CTGF融合蛋白包被孔OD450平均值為2.96，陰性對照OD450平均值為0.18，以測定值大於2倍陰性對照OD值為CutOff值，判定測定結果為陽性。
CTGF融合蛋白分別置於-20℃、4℃、37℃保存，每周測定一次免疫學活性，至12周時OD450平均值分別為2.85、2.79和2.61，活性分別為96.3％、94.2％和88.2％，顯示該融合蛋白具有較高的穩定性。
權利要求
1.一種結締組織生長因子C區抗原的製備方法，其特徵在於第一步用NheI和XbaI酶對pCOMB3載體進行雙酶切，切除兩酶切位點NheI和XbaI之間的272bp條帶後的載體用T4 DNA連接酶自連後轉化大腸桿菌JM109，然後，以質粒pET-28(a)+作模板，分別以p15』-GGCTCGAGGCCAACTCTAGTATGGCCC-3』及p25』-GGACTAGTCTAACCAGCACTTCAGTGGGAA-3』為上、下遊引物，PCR擴增後，可見550bp條帶的擴增產物，回收該條帶，並將回收的條帶與被切除272bp後的pCOMB3載體連接，經轉化JM109後篩選得到陽性質粒pKM；第二步用組織貼壁法進行人內皮細胞原代培養，用50mmol/L葡萄糖修飾的牛血清白蛋白對原代培養後的內皮細胞幹預8h，0.125％胰蛋白酶消化後，用Trizol法提取RNA，用逆轉錄試劑盒合成cDNA，在1.5ml管中依次加入雙蒸H2O 31.5μl，10×Taq buffer 5μl，10mol/LdNTP 1μl，濃度為25pmol/μl的引物p35』-CCCGGATCCGAAGCGGACCTAGAG-3』1μl，p45』-CCCAAGCTTTGCCATGTCTCCGTG-3』1μl，濃度為0.65μg/μl的cDNA模板10μl，濃度為5U/μl的TaqPlus聚合酶0.5μl，置於PCR儀擴增，擴增條件94℃ 5min變性，94℃ 1min，65℃ 30sec，72℃ 1min，35個循環，72℃延伸10min，4℃保溫，再用SpeI和XhoI酶對PCR產物與陽性質粒pKM分別進行雙酶切後，用T4DNA連接酶使兩個片段通過粘性末端相連，轉化大腸桿菌JM109，從中獲得陽性質粒pKMc1；第三步將含陽性質粒pKMc1的大腸桿菌JM109單菌落擴增後，用異丙基-β-D-硫代半乳糖苷37℃誘導3h，得到含有結締組織生長因子C區242-349位胺基酸的大腸桿菌，超聲破碎細胞，用鎳離子樹脂親和層析獲得結締組織生長因子抗原。
全文摘要
結締組織生長因子抗原的製備方法，對pCOMB
文檔編號C12P19/34GK1552890SQ20031011267
公開日2004年12月8日 申請日期2003年12月18日 優先權日2003年12月18日
發明者劉乃豐, 吳國球 申請人:東南大學