一種烷基糖苷類生物抑菌劑的製作方法

2023-05-25 00:06:51 1

一種烷基糖苷類生物抑菌劑的製作方法
【專利摘要】本發明涉及一種烷基糖苷類生物抑菌劑的分離、純化和鑑定。本發明從來源於泌乳奶牛牛糞中分離出了鏈黴菌NF0919菌株發酵產物提取、分離、純化得到的一種烷基糖苷類化合物。經試驗證實，該化合物具有多種抗菌效果。
【專利說明】一種烷基糖苷類生物抑菌劑
【技術領域】:
[0001]本發明涉及一種烷基糖苷類化合物的提取、分離、純化與鑑定，且該化合物具有抑制水稻紋枯病菌的作用，可以作為一種生物抑菌劑進行使用。
【背景技術】:
[0002]植物病原真菌是危害農作物的主要病原微生物類群，給農業生產造成巨大的損失。目前，化學農藥在控制植物病害造成的損失上仍起著主要作用。但是化學農藥的大量使用，已經對人類環境造成了嚴重的危害，並且增加了病害的抗藥性。從天然資源中尋找活性物質代替化學農藥和使用天然抗菌化合物保護作物已成為當前研究的重點。
[0003]農用抗生素(Agricultural antibiotics)是由細菌、真菌、放線菌等微生物在發酵過程中所產生的次級代謝產物，能在低濃度下選擇性的防治農作物病蟲害，或調節植物生長發育(鄧洪淵，2005)。這類物質均為化學結構複雜的非單一化合物，具有良好的內吸性和選擇性，可直接利用或經過加工改造而製成(文才藝，2004)。後來人們將具有抗病毒、抗癌細胞、抑制酶活性的微生物產生的活性物質也歸入其範疇之中。
[0004]農用抗生素是隨著醫用抗生素的發展而發展起來的，至今不過50多年的歷史。最早美國、日本先後採用鏈黴素(Streptomycin)、土黴素(Oxytertracyline)、灰黃黴素(Griseofulvin)等醫用抗生素來防治植物病害,取得了一定效果。1944年,Brown和Boyle採用青黴素的粗品有效地防治了由幾種細菌引起的冠癭病(唐韻，2003)。1946年，美國厄普約翰公司研究發現放線菌酮(Cycloheximide)對植物真菌類有高度的抗菌活性,之後人們又發現了鏈黴素和氯黴素等對植物細菌和真菌病害有很好的防治效果，從而意識到抗生素在農業上的發展潛力。1958年日本研製成功殺稻痕素-S(Bblasticidin-S),並於1961年大面積應用於稻瘟病的防治，基本上取代了有機汞，有機砷等毒性高，對環境汙染嚴重的化學農藥，使農用抗生`素的研究進入了一個新的階段。隨後又相繼開發了春日黴素(Kasugamycin)、多氧黴素(Polyoxin)、有效黴素(Vzlidamycin)等高效低毒無公害的新的農用抗生素並遠銷許多國家(沈寅初，1996)。尤其近幾年，日本還研究篩選出新的殺蟲素和除草素，從而進一步加速了農用抗生素的發展，從而引起各國的重視。俄羅斯、美國、日本、德國、義大利、印度、丹麥等國已把農用抗生素的研究開發列入國家重點計劃，受到特別重視。我國是農用抗生素生產與應用的大國，也是農用抗生素研究開展較早的國家，開始於上個世紀50年代初期。1953年，著名植病學家尹萃耘先生從陝西徑陽分離到「5406」菌株，對棉花黃枯萎病有一定的防治效果，揭開了我國農用抗生素研究的序幕。當時國內農用抗生素研究基礎進展較慢，到70年代以後才逐漸取得較大突破進入蓬勃發展時期。相繼成功開發了井網黴素、春雷黴素、農抗120、多抗黴素、滅痕素、公王嶺黴素、瀏陽黴素、旲能黴素、南昌黴素等，為我國農用抗生素的發展應用奠定了基礎。其中井R黴素是目前為止我國最成功的農用抗生素，其產生菌與日本早期發現的有效黴素結構相似，稱為吸水鏈黴菌井岡變種(Strepomyces hygroscopicus var jinggonggensis yen)(沈寅初，1985),對水稻紋枯病有特效，它的成功開發使我國水稻紋枯病從此得到了有效控制。進入90年代，我國的農用抗生素研究開發進入一個新的發展高潮，研製成功了阿維菌素、中生菌素、寧南黴素和華光黴素等農用抗生素品種，成為世界上生產抗生素產量最多的國家之一(沈寅初，1997;商瑞，2008)。從產業化規模和研究深度上來看，阿維菌素、井R黴素、赤黴素、蘇雲金桿菌(簡稱Bt) 4個品種已成為我國生物農藥產業中的領軍產品，而農用抗生素中鏈黴素、農抗120、多抗黴素和中生菌素等品種已成為我國生物農藥產業的中堅力量。以上產品已佔到生物農藥現有市場規模的90%左右，它們的發展趨勢代表了我國未來生物農藥產業市場的發展方向(魏海燕，2008)。農用抗生素的迅速發展和新產品不斷投放市場，使得該領域的研究方興未艾，已成為研製新農藥的一條主要途徑(Copping LG, 2007;Dayan FE，2009)。
[0005]經田間連續多年的防治試驗證明，我室篩選的生防新菌種一黃麻鏈黴菌(Streptomyces corchorusii) NF0919菌株的發酵代謝產物對葡萄炭疽病等重大為害高效農業作物的病原菌有很好防控效果，菌種詳細信息請見授權專利ZL201010236886.1。

【發明內容】
:
[0006]本發明的目的在是提供一種具有抑菌效果的烷基糖苷類化合物的分離純化鑑定方法，其特徵是含有烷基糖苷類結構骨架，命名為:6 (2-甲基_3，5，6-三羥基-四氫吡喃-4-氧基)-3，4，5-三羥基-四氫吡喃-2-羧酸-2，3，4，5，5-羧酸-庚脂，結構式如圖6所示，圖6中R1、R2、R3、R4、R5、R6均為甲基。
[0007]上述的圖6化合物的製備方法，菌株提取液草酸沉澱後離心濃縮成褐色浸膏，乙酸乙酯超聲提取，提取液濃縮為浸膏；用氯仿和甲醇進行矽膠柱梯度洗脫後，用甲醇與水進行葡聚糖凝膠LH-20柱梯度洗脫，分離純化。
[0008]上述的圖6化合物經高效液相色譜分析後進行核磁共振譜分析確定結構式。
[0009]上述的圖6化合物可用於防治水稻紋枯病。
[0010]`[0011]
[0012]
[0013]本發明採用活性物質跟蹤分離純化方法，測試了發酵原液、發酵提取液、各餾分純化液和圖6化合物對水稻紋枯病菌的抑制作用。經試驗證實發酵原液、發酵提取液、各餾分純化液和圖6化合物對水稻紋枯病菌都具有抑制作用，其中圖6化合物對水稻紋枯病菌的抑制作用最大，圖6化合物可溶於水和甲醇，黃色油狀物，可以作為一種生物抑菌劑用於水稻病菌的防治中。
【專利附圖】

【附圖說明】:
[0014]圖1為本發明方法的流程圖；
[0015]圖2為本發明方法的核磁共振氫譜圖；
[0016]圖3為本發明方法的核磁共振碳譜圖；
[0017]圖4為本發明方法的分子結構圖(加C、H位移)，(i中阿拉伯數字為核磁共振譜中碳原子的化學位移，?中阿拉伯數字為核磁共振譜中氫原子的化學位移)；
[0018]圖5為空白對照(i)，發酵原液(ii)，發酵提取液(iii)和單體化合物(iiii)的抑菌活性；[0019]圖6為本發明方法的分子結構圖(化學物結構式)
【具體實施方式】:
[0020]I菌種的發酵
[0021]將冰箱裡保存的NF0919斜面在高氏一號培養基上活化，30°C培養10d，挑取Icm2大小的菌塊接種於種子培養基中(250ml三角瓶裝量50ml)，置於搖床上180rpm，30°C培養40h，按10%的接種量接入發酵培養基中(250ml三角瓶裝量50ml)，置於搖床上180rpm，30°C 培養 7d。
[0022]2抗菌活性物質的提取
[0023]將發酵液離心，濾液加草酸調pH至3.5，靜止2h後離心，濾液濃縮成褐色糊狀。濃縮液:乙酸乙酯=1:2比例進行超聲輔助萃取0.5h，反覆萃取數次至萃取液無色透明。將乙酸乙酯萃取液真空濃縮成浸膏。
[0024]3洗脫液抗菌活性檢測
[0025]以水稻紋枯病菌為指示菌，進行抗菌活性檢測。將含有抗菌活性的洗脫液分別濃縮至幹。得到抗菌物質粗品。將0.5mL藥液與9.5mL培養基在培養皿內混勻，製成含各樣品20倍的PSA培養基，採用無菌水作空白對照，各處理重複2次。將保留的水稻紋枯病菌轉接到PSA平皿中，在25°C下活化48h，然後在近菌落邊緣用打孔器製取直徑為4mm的菌餅，並轉接到含藥的PSA平皿和空白對照中。25°C培養48h，待對照中菌落快長滿平皿時，採用十字交叉法量取菌落直徑。計算菌落直徑均值，並按照下列公式計算菌絲生長平均抑制率:菌絲生長平均抑制率={(對照菌落直徑均值-處理菌落直徑均值)/ (對照菌落直徑均值-接種菌餅直徑)} X 100%`
[0026]4抗真菌活性物質純品的製備
[0027](I)矽膠柱梯度洗脫:經條件摸索後確定甲醇:氯仿=AlOO:0、B95:5、C90:10、D85:15、E80:20、F75:25、D70:30、H65:35.將提取液上柱子，按照梯度洗脫條件進行梯度洗脫，收集餾分合併後得wl、w2、w3、w4、w5、w6.(以抑菌率為標準確定有效成分的含量)結果見表
1.[0028](2)葡聚糖凝膠柱梯度洗脫:經條件摸索後確定甲醇:水=A100:0、B95:5、C90:10、D85:15、E80:20、F75:25、D70:30、H65:35、I60:40、G55:45、K50:50。將矽膠層析後的 Wl 餾分濃縮後上葡聚糖凝膠柱，按照梯度洗脫條件進行梯度洗脫，收集餾分合併後得Wl-1、W1-3、Wl-8、Wl-10、Wl-11、Wl-12、Wl-13、Wl-14、W1-15。(以抑菌率為標準確定有效成分的含量)結果見表1.[0029]表1分離純化各餾分的抑菌率
[0030]
【權利要求】
1.一種烷基糖苷類化合物，其特徵是含有烷基糖苷類結構骨架，結構式為圖6所示，命名為:6 (2-甲基-3，5，6-三羥基-四氫吡喃-4-氧基)-3，4，5-三羥基-四氫吡喃_2_羧酸-2，3,4, 5，5-羧酸-庚脂。
2.如權利要求1所述的圖6化合物，其特徵所述的町、1?2、1?3、1?4、1?5、1?6均為甲基。
3.權利要求1所述的圖6化合物的製備方法，菌株提取液草酸沉澱後離心濃縮成褐色浸膏，乙酸乙酯超聲提取，提取液濃縮為浸膏；用甲醇與水進行葡聚糖凝膠LH-20柱梯度洗脫後，反覆用氯仿和甲醇進行矽膠柱梯度洗脫，分離純化。
4.權利要求1所述的圖6化合物經高效液相色譜分析後進行核磁共振譜分析確定結構式。
5.權利要求1所述的 圖6化合物可用於防治水稻紋枯病。
【文檔編號】C07H1/06GK103804437SQ201310196997
【公開日】2014年5月21日 申請日期:2013年5月22日 優先權日:2013年5月22日
【發明者】張文文, 楊敬輝, 莊義慶 申請人:江蘇丘陵地區鎮江農業科學研究所