一種適於榆屬品種區分和鑑定的issr指紋圖譜構建方法

2023-05-11 00:13:06 1

專利名稱：一種適於榆屬品種區分和鑑定的issr指紋圖譜構建方法
技術領域：
本發明涉及一種ISSR指紋圖譜構建方法。
背景技術：
榆樹為榆科(Ulmaceae)榆族(Ulmeae)的榆屬(Ulmus)植物的總稱。全世界約 40餘種，分布於北半球。我國榆屬資源非常豐富，遍及全國，共有25種。榆屬植物耐旱，耐鹽鹼，適應性強，木材堅韌，具有較高的生態適應性和經濟價值，多數榆屬品種可塑性強，即可作為孤植樹、行道樹，也可剪型成為綠籬、盆景，具有很高的觀賞價值和應用價值，因此， 具有其他樹種不可替代的優勢，一直是我國北方尤其是鹽鹼地園林綠化中的主要樹種。因此對榆屬新品種的培育一直是育種人員的研究熱點。目前，中國分布的有代表性榆屬種、品種及類型，以及選出的優良無性系品種大概在88份左右，但對於這些品種的鑑定仍只是基於傳統的形態鑑定法依賴於品種表型差異，而形態的表現受環境影響較大，且形態鑑定法工作量大、鑑定周期長、成本高、受季節限制。而同工酶和種子貯藏蛋白多態性不夠豐富，且同工酶有組織和器官特異性、穩定性差，這就給榆屬品種鑑定、榆屬種質資源創新帶來了困難。分子標記技術具有多態性好、遺傳穩定、不受環境條件影響等優點，已開始廣泛應用於作物品種鑑定與純度檢測中。目前，應用較多的是ISSR、SSR、RAPD、RFLP和AFLP等分子標記。簡單重複序列多態性(Inter-simple sequence Repeat Polymorphism, ISSR)是由 Zietkiewicz於1994年提出的。ISSR通常為顯性標記,呈Mendel式遺傳,具有很好的穩定性和多態性，因而是非常理想的分子標記，可用於構建PCR為基礎的分子圖譜。ISSR分子標記已用於遺傳多樣性分析、繪製DNA指紋圖譜、品種鑑定等許多研究領域，潛力很大。ISSR 技術利用基因組中有關SSR序列的信息，結合RAPD技術優點，克服了 SSR和RAPD標記技術的某些缺點；與RFLP、AFLP相比，ISSR更快捷、成本較低、DNA用量小、安全性較高。對榆屬植物的遺傳多樣性的研究、染色體的研究、ISSR、RAPD及AFLP等分子標記技術在榆樹中的應用研究等尚處於起步甚至空白階段。除了白榆之外的其它榆屬樹種，則基本上沒有開展指紋圖譜等遺傳研究。

發明內容
本發明的目的在於提供一種適於榆屬品種區分和鑑定的ISSR指紋圖譜構建方法。適於榆屬品種區分和鑑定的ISSR指紋圖譜構建方法按以下步驟進行一、DNA 提取以不同榆樹品種成年植株為材料，取新生葉片採用適合提取榆樹DNA的改良CTAB 法提取DNA，取部分DNA溶液測其濃度，稀釋至20ng/uL，於_20°C保存備用；二、ISSR-PCR擴增及電泳檢測採用25μ L 反應體系中，10XBuffer(Mg2+free)2. 5μ L，dNTPs O. 25mmol/L，引物800pmol/L, DNA 模板 30ng, Taq 酶 I. 5U, MgCl2 2. 5mmol/L ；PCR擴增程序條件為94°C預變性5min，35個循環，每個循環包括，94°C變性45s， 退火lmin,72°C延伸I. 5min,結束循環後72°C延伸6min,4°C保存；用含O. 5μ 1/mlEB的I. O %瓊脂糖凝膠，在IXTBE緩衝液中，以2. 5V/cm2的電場強度電泳，在紫外凝膠成像系統上觀察並照相、記錄；三、DNA指紋圖譜構建根據每條引物呈現的條帶信息建立指紋圖譜以榆樹品種編號和擴增譜帶帶型為縱列，以每條譜帶的位點編號為橫行，在每一橫縱交結處，有擴增譜帶用「 I」表示，沒有擴增譜帶用「O」表示，分別製得每條引物對不同品種的DNA指紋圖譜表，以引物FI-55對35個
偷樹品種構建的指紋圖譜為
權利要求
1.一種適於榆屬品種區分和鑑定的ISSR指紋圖譜構建方法，其特徵在於適於榆屬品種區分和鑑定的ISSR指紋圖譜構建方法按以下步驟進行一、DNA提取以不同榆樹品種成年植株為材料，取新生葉片採用適合提取榆樹DNA的改良CTAB法提取DNA，取部分DNA溶液測其濃度，稀釋至20ng/uL，於_20°C保存備用；二、ISSR-PCR擴增及電泳檢測採用 25 yL 反應體系中，10XBuffer(Mg2+free)2. 5μ L，dNTPsO. 25mmol/L,引物 800pmol/L, DNA 模板 30ng, Taq 酶 I. 5U, MgCl2 2. 5mmol/L ；PCR擴增程序條件為94°C預變性5min，35個循環，每個循環包括，94°C變性45s，退火 lmin，72°C延伸I. 5min，結束循環後72°C延伸6min，4°C保存；用含O. 5μ 1/mlEB的I. O %瓊脂糖凝膠，在IXTBE緩衝液中，以2. 5V/cm2的電場強度電泳，在紫外凝膠成像系統上觀察並照相、記錄；三、DNA指紋圖譜構建根據每條引物呈現的條帶信息建立指紋圖譜以榆樹品種編號和擴增普帶帶型為縱列，以每條譜帶的位點編號為橫行，在每一橫縱交結處，有擴增譜帶用「 I 」表示，沒有擴增譜帶用「O」表示，分別製得每條引物對不同品種的DNA指紋圖譜表，以引物FI-55對35個榆樹品種構建的指紋圖譜為
2.根據權利要求I所述的一種適於榆屬品種區分和鑑定的ISSR指紋圖譜構建方法，其特徵在於步驟三中所用榆屬的具體品種如下作圖品種其中作圖品種I 9採自黑龍江省帽兒山和黑龍江森林植物園；作圖品種10 18和鑑定品種I 17均採自山東省金鄉縣白窪林場。
全文摘要
一種適於榆屬品種區分和鑑定的ISSR指紋圖譜構建方法，它涉及一種ISSR指紋圖譜構建方法。方法一、DNA提取；二、ISSR-PCR擴增及電泳檢測；三、DNA指紋圖譜構建；四、利用構建的DNA指紋圖譜進行榆屬品種鑑定，即完成。本發明有利於對榆屬品種進行快速、準確的鑑定，與常規的種植檢驗和生化檢驗相比，不受作物生長環境和季節的影響，結果更穩定、可靠，且省時省力；構建DNA指紋圖譜和鑑定技術使ISSR分子標記技術在植物品種鑑定、親緣關係分析、植物種質資源創新和分子標記輔助育種中的廣泛推廣應用打下良好的基礎；操作簡單、直觀實用等特點。
文檔編號C12Q1/68GK102605061SQ20121005836
公開日2012年7月25日 申請日期2012年3月7日 優先權日2012年3月7日
發明者關向軍, 唐煥偉, 孫力, 張興, 熊燕, 王云云, 肖宇, 高宇 申請人:黑龍江省科學院大慶分院