一種黃芪甲苷衍生物及其製備方法和應用與流程

2023-05-10 20:58:06 3

本發明屬於醫藥技術領域，具體涉及一種具有心血管疾病預防和治療活性的黃芪甲苷衍生物黃芪苷酸或其可藥用鹽、酯和醯胺的製備方法及用途。

背景技術：

黃芪甲苷是中藥黃芪的主要活性成分之一，也是《中國藥典》中多種中藥複方製劑的定性定量指標成分。藥理學研究表明，黃芪甲苷具有可改善心肺功能、增強機體免疫力、抗病毒、抗應激等多種功效(Ren S,et al.Pharmacological effects of Astragaloside IV:a literature review.Journal of Traditional Chinese Medicine,2013,33(3):413-416)。雖然黃芪甲苷藥效顯著，但其水溶性差、胞膜通透性差，決定了其吸收不好，生物利用度低，成藥性很差。如黃芪甲苷在大鼠模型中的絕對生物利用度僅有2.2％(Gu Y,et al.Transport and bioavailability studies of Astragaloside IV,an active ingredient in Radix Astragali.Basic&Clinical Pharmacology&Toxicology,2004,95(6):295–298)。這些嚴重阻礙了其單方製劑的開發，尤其是注射液、大輸液等水溶性劑型的開發。目前有少量研究通過製劑的方式來增加其水溶性，如將其製成糊精包合物(CN100393319C；陳國廣,陳振華,劉伯成,等.羥丙基-β-環糊精對黃芪甲苷包合作用的研究.時珍國醫國藥,2007,18(6):1457-1458)或磷脂複合物(劉愛娜,陳昊,唐星.黃芪甲苷脂質微球注射液的製備及其物理穩定性研究.中國藥劑學雜誌:網絡版,2009(4):290-298)。

眾多學者希望通過引入水溶性基團的方法直接增加黃芪甲苷水溶性，以更適合於藥物(尤其是一類新藥)的開發。但是，由於黃芪甲苷分子活性反應位點較多：涉及伯、仲、叔三種不同類型9個羥基的保護與脫保護、兩個糖鏈在反應過程中極易脫落、母核中的環丙烷結構和四氫呋喃環結構均極易開環，因此，到目前為止尚無一個切實可行的方法製備黃芪甲苷水溶性衍生物。如任戎嘗試合成了水溶性的黃芪甲苷-C6」-O-磷酸酯衍生物，但是該合成路線副反應多、收率低、分離純化複雜，而且藥代預試驗表明該衍生物並不具有前藥性質(任戎.黃芪甲苷的提取及其磷酸酯水溶性前藥的合成研究[D].天津大學碩士學位論文,2009)。

技術實現要素：

本發明的第一目的在於提供一種具有式1結構的化合物(我們將其命名為黃芪苷酸)或其可藥用鹽、酯和醯胺，其結構式為：

本發明的第二目的在於提供具有式1結構的化合物的製備方法，巧妙地實現了將黃芪甲苷分子中特定醇羥基定向氧化為羧基，得到黃芪苷酸。該方法步驟簡單、反應條件溫和、副反應小、收率高，適合規模化生產。

本發明的第三目的在於提供具有式1結構的化合物或其藥學上可接受的鹽、酯和醯胺的應用，即用該化合物來預防與治療心血管疾病。

為了實現本發明的上述目的，特採用以下技術方案：

本發明所述的具有式1結構的化合物的製備方法，主要包括如下步驟：

取一定量的黃芪甲苷，加入到0.1～10倍質量的第一溶劑中，依次加入0.01～5倍質量的滷化鹼、0.01～5倍質量的哌啶類氮氧化合物、0.01～5倍質量的次滷酸或其鹽，在-10℃～100℃中反應10～600min，過濾，濾液用酸調pH至酸性，待固體析出後，濃縮，固液分離，固體用第二溶劑溶解、轉移、濃縮至幹，得白色粉末即為具有式1結構的化合物。

根據上述製備方法製得的具有式1結構的化合物或其可藥用鹽、酯和醯胺，包括：具有式1結構的化合物與鹼金屬、鹼土金屬、無機氨、有機胺在常規的成鹽條件下所形成的鹽，具有式1結構的化合物與醇在常規的酯化條件下所形成的酯，和具有式1結構的化合物與無機氨、有機胺在常規的成醯胺條件下所形成的醯胺。具體而言，指其鉀鹽、鈉鹽、鈣鹽、鋰鹽、鐵鹽、鋅鹽、鎂鹽、銨鹽、一甲胺鹽、二甲胺鹽、三甲胺鹽、乙二胺鹽、一乙醇胺鹽、二乙醇胺鹽、三乙醇胺鹽、一乙胺鹽、二乙胺鹽、三乙胺鹽，以及甲酯、乙酯、丙酯、異丙醇酯、丙二醇酯、丁酯、叔丁酯、甘油酯、甲醯胺、乙醯胺、哌嗪醯胺、氫化吡啶醯胺、咪唑醯胺、吡咯醯胺或哌啶醯胺。

本發明還提供了具有式1結構的化合物或其可藥用鹽、酯和醯胺在心血管疾病預防和(或)治療中的應用。

通過對體外培養心肌細胞缺氧損傷的保護作用實驗，發現具有式1結構的化合物可顯著提高急性缺氧復氧誘導的心肌細胞存活率和線粒體活性，降低心肌酶釋放，減輕細胞氧化損傷，對體外培養的心肌細胞缺氧損傷表現出亦具有顯著的保護作用，提示了具有式1結構的化合物在製備抗急性心肌缺血藥物中的用途。

本發明還提供了一種可用於心血管疾病預防和(或)治療作用的藥物組合物，它是由有效量的所述的化合物為活性成分，加入藥學上可接收的輔料製備而成的製劑。其中，所述的製劑是口服製劑或者注射製劑。

與現有技術相比，本發明的有益效果為：

①明顯增加了黃芪皂苷類化合物的水溶性，大大改善了黃芪甲苷的成藥性，可以將所得到的具有式1結構的化合物或其可藥用鹽、酯和醯胺為單方製劑開發，尤其是注射液、大輸液等水溶性劑型的開發。

②經檢索，本發明所得的具有式1結構的化合物或其可藥用鹽、酯和醯胺是全新結構的化合物，可作為活性先導化合物開發成一類新藥。

③本發明提供的具有式1結構的化合物或其可藥用鹽、酯和醯胺的製備方法，巧妙地一步反應即實現了黃芪甲苷分子中特定醇羥基的定向氧化，步驟簡單、反應條件溫和、副反應小、收率高，容易實現，適合工業大生產。

④藥理學實驗表明，具有式1結構的化合物或其可藥用鹽、酯和醯胺具有保護心肌細胞缺氧損傷作用，可用於心血管疾病的預防和(或)治療。

附圖說明

為了更清楚地說明本發明實施例或現有技術中的技術方案，以下將對實施例或現有技術描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹。

圖1為具有式1結構化合物部分關鍵結構單元的HMBC相關信號；

圖2為具有式1結構化合物對缺氧復氧誘導損傷心肌細胞細胞存活率的影響(X土s，n＝6～8)與NOEMOXIA組比較，###P<0.001，與H/R組比較，***P<0.001；

圖3為具有式1結構化合物對缺氧復氧誘導損傷心肌細胞線粒體活性的影響(X土s，n＝6～12)與NOEMOXIA組比較，###P<0.001，與H/R組比較，*P<0.05,***P<0.001；

圖4為具有式1結構化合物對缺氧復氧誘導損傷心肌細胞LDH、CK的影響(X土s，n＝3)與NOEMOXIA組比較，###P<0.001，與H/R組比較，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。

具體實施方式

下面將結合實施例對本發明的實施方案進行詳細描述，但是本領域技術人員將會理解，下列實施例僅用於說明本發明，而不應視為限制本發明的範圍。實施例中未註明具體條件者，按照常規條件或製造商建議的條件進行。所用試劑或儀器未註明生產廠商者，均為可以通過市售購買獲得的常規產品。

實施例1

本實施例提供權利要求1所述的具有式1結構的化合物的製備方法及其結構鑑定：

(1)化合物製備：取100mg黃芪甲苷，加入到500mL的10％吡啶中，依次加入25mg溴化鈉、5mg的2,2,6,6-四甲基哌啶-1-氧自由基、1mL次氯酸鈉，在0℃中反應120min，過濾，濾液用濃鹽酸調pH 3，待固體析出後，濃縮至20mL，固液分離，固體用甲醇溶解轉移，濃縮至幹，得白色粉末89.7mg即為具有式1結構的化合物(HPLC純度98.8％)。

(2)結構鑑定：

白色無定形粉末；TLC展開後噴5％濃硫酸/乙醇顯紫紅色；(c,1.0,MeOH)；IR(KBr)：Vmax：3417,2968,1732,1621,1378,1156,1066,1045cm-1。HR-ESI-MS準分子離子峰m/z[M+Na]+821.4294(Calcd.forC41H66NaO15:821.4294)，推斷該化合的分子式為：C41H66O15。

1H NMR顯示有2個糖基異頭氫信號：δH 5.05和δH 4.83，13C NMR也顯示了2個相應的碳信號：δC 107.4和105.4，據此推測化合物含有2個糖基片段。負離子ESI-MS顯示m/z 797[M-H]-，MSn碎片峰分別為m/z 621[(M-H)-177]-(掉一個葡萄糖醛酸基)、665[(M-H)-132]-(掉一個木糖基)；將該化合物酸水解後，TLC顯示在葡萄糖醛酸和木糖相同位置處有顯色斑點；這些結果表明糖鏈由葡萄糖醛酸和木糖兩種構成。

1H-NMR譜圖上在δH 1.96、1.53、1.35、1.29、1.26、1.24和0.96處顯示7個甲基信號峰，通過與黃芪甲苷的13C NMR數據對照，確定該化合物的母核未變化，仍然為環阿屯烷型。結合上述2個糖基的分析，表明苷元為黃芪皂苷元。

與黃芪甲苷相比，化合物的13C NMR顯示有一個的羧基信號峰δC172.7，沒有黃芪甲苷的葡糖基6」信號峰；化合物的13C NMR顯示苷元的C-3和C-6均產生了苷化位移，分別是δC88.2和δC 79.0，從而確定化合物糖基應該連接在苷元的C-3和C-6位；HMBC譜上木糖H-1與苷元C-3、葡萄糖醛酸H-1與苷元C-6之間的遠程相關證實這種推測。HMBC譜的關鍵遠程相關見圖1。

綜合ESI-MSn、HR-ESI-MS、1H NMR、13C NMR、DEPT、1H-1H COSY、HMBC、HMQC等波譜分析，並與黃芪甲苷對照，鑑定化合物結構為式1。經查，該化合物為一個新化合物，命名為黃芪苷酸。式1化合物的NMR數據見表1。

表1黃芪苷酸13C-NMR(150MHz)及DEPT數據(C5D5N)

實施例2

本實施例提供權利要求1所述的具有式1結構的化合物的製備方法，與實施例1相比不同之處在於調整了溶劑和試劑的比例：

取100mg黃芪甲苷，加入到50mL的水中，依次加入25mg溴化鈉、10mg的2,2,6,6-四甲基哌啶-1-氧自由基、0.25mL次氯酸鈉，在20℃中反應120min，過濾，濾液用濃鹽酸調pH 2，待固體析出後，濃縮至10mL，固液分離，固體用乙醇溶解轉移，濃縮至幹，得白色粉末91.3mg即為具有式1結構的化合物(HPLC純度99.1％)。

實施例3

本實施例提供權利要求1所述的具有式1結構的化合物的製備方法，與實施例1相比不同之處在於調整了溶劑和試劑的比例：

取100mg黃芪甲苷，加入到10mL的10％DMF中，依次加入20mg溴化鈉、8mg的2,2,6,6-四甲基哌啶-1-氧自由基、0.20mL次氯酸鈉，在0℃中反應120min，過濾，濾液用濃鹽酸調pH 3，待固體析出後，濃縮至10mL，固液分離，固體用乙醇溶解轉移，濃縮至幹，得白色粉末82.7mg即為具有式1結構的化合物(HPLC純度97.9％)。

實施例4

本實施例提供權利要求1所述的具有式1結構的化合物的製備方法，與實施例1相比不同之處在於調整了溶劑和試劑的比例：

取100mg黃芪甲苷，加入到1L水中，依次加入500mg溴化鈉、500mg的2,2,6,6-四甲基哌啶-1-氧自由基、5mL次氯酸鈉，在0℃中反應120min，過濾，濾液用濃鹽酸調pH 2，待固體析出後，濃縮至10mL，固液分離，固體用乙醇溶解轉移，濃縮至幹，得白色粉末86.8mg即為具有式1結構的化合物(HPLC純度98.2％)。

實施例5

本實施例提供權利要求13所述的具有式1結構的化合物(本實施例中以DQ798作代號)對體外培養心肌細胞缺氧損傷的保護作用：

1、實驗方法：

1.1大鼠心室肌細胞系H9c2細胞培養：H9c2細胞培養於含10％FBS的高糖DMEM培養基中,於5％CO2，飽和溼度及37℃條件下培養，每2～3d更換一次培養基，當細胞達到80-90％融合時傳代或凍存或進入實驗。將對數生長期的細胞以8×104或1.2×105cells/ml的密度分別接種於96或6孔板中，於常規細胞培養箱中培養。

1.2心肌細胞缺氧再復氧模型建立：取培養48h的H9c2細胞，用K-B buffer(預先充入95％N2-5％CO2混合氣飽和30min)替代正常培養基，而後迅速將培養板移入通有95％N2-5％CO2混合氣的缺氧裝置中，37℃缺氧培養3h。取出培養板，更換正常培養基並置於常規培養箱復氧3h。

1.3實驗分組：實驗設正常對照組(Normoxia)、缺氧復氧組(H/R)、DQ798預處理組高、中、低劑量組(2.5、5和10mg/L)，共5組，每組設6復孔。除正常對照組外，其他各組均缺氧處理3h再復氧3h，正常對照組則於37℃、5％CO2培養箱中同步孵育6h。

1.4 MTT檢測方法：取出各組樣本，每孔加入20ul MTT(5g/L)，於37℃、5％CO2箱中繼續孵育4h，終止培養，倒板。加入150ul DMSO振搖15min，使結晶充分溶解，於測定波長570nm、參考波長630nm處，測定各孔吸亮度(OD)值。

MTT代謝率(％)＝實驗組OD值/正常對照組OD值X 100％

1.5線粒體活性檢測:按照線粒體活性試劑盒(Abcam,USA)標準操作，多孔讀板儀(Infinite M200pro microplate reader)讀取螢光強度(590nm/550nm)計算活性強度。

1.6生化指標檢測：取培養於24孔板的各組細胞培養上清液，用比色法測定LDH、CK活性，用黃嘌呤氧化酶法測定細胞內SOD活性；用硫代巴比妥酸比色法測定細胞內MDA含量，具體檢測過程及操作方法按試劑盒說明書進行。

2.實驗結果：

2.1 DQ798顯著提高心肌細胞存活率

與Normoxia組比較，H/R組細胞存活率明顯降低(P<0.01)。2.5、5和10mg/L DQ798預處理組能夠提高細胞存活率，其作用並呈濃度依賴關係。5和10mg/L DQ798預處理組明顯提高細胞存活率為76.04％(P<0.01)和82.44％(P<0.001)，結果如圖2所示。

2.2 DQ798顯著提高心肌細胞線粒體活性

體外培養心肌細胞由缺氧復氧誘導損失後，線粒體功能異常，氧化呼吸鏈受損，ATP產生減少。通過快速檢測細胞內線粒體活性，可以提示化合物對線粒體損失的保護作用。本實驗結果顯示：2.5、5和10mg/L DQ798預處理組，螢光分光亮度計測得螢光強度顯著高於H/R組，表明均可顯著增加線粒體活性(P<0.01)，結果如圖3所示，說明DQ798能對抗缺氧復氧對心肌細胞線粒體的損害，可能通過保護線粒體功能發揮心肌細胞保護作用。

2.3 DQ798顯著降低缺氧誘導心肌酶升高

缺氧復氧導致心肌細胞損傷時，心肌損傷標誌物LDH和CK將明顯升高。2.5、5和10mg/L DQ798預處理組的3個劑量組與H/R組相比，LDH、CK均明顯降低，表明DQ798可在急性缺氧條件下保護心肌細胞，上述結果見圖4。

3實驗結論

DQ798可顯著提高急性缺氧復氧誘導的心肌細胞存活率和線粒體活性，降低心肌酶釋放，減輕細胞氧化損傷，對體外培養的心肌細胞缺氧損傷表現出具有顯著的保護作用，提示了DQ798在製備抗急性心肌缺血藥物中的用途。