一種6α－甲基氫化潑尼松的製備方法

2023-05-11 00:19:36 4

專利名稱：一種6α－甲基氫化潑尼松的製備方法
技術領域：
本發明涉及一種重要的甾類藥物中間體——6α-甲基氫化潑尼松1，4-二烯-6α-甲基-3，20-二酮-11β，17α-二羥基孕甾(又稱甲基潑尼松龍)的製備方法，屬於生物轉化技術領域。
背景技術：
甲基潑尼松龍是生產甲基潑尼松龍琥珀酸鈉製劑成品藥的關鍵原料，該產品特點是療效確切，副作用小，臨床主要用於消炎、抗病毒、人體器官移植抗排異反應，以及各種危急病人休克的急救用藥。甲基潑尼松龍生產工藝中涉及到一步中間體的脫氫反應。目前通常採用化學法脫氫，以二氯二氫苯醌作為催化劑，該工藝路線的副反應較多、收率偏低，對環境汙染較大。
6α-甲基氫化可的松4-烯-6α-甲基-3，20-二酮-11β，17α-二羥基孕甾的1，2位脫氫反應過程如下 底物A 產物B底物A4-烯-6α-甲基-3，20-二酮-11β，17α-二羥基孕甾產物B1，4-二烯-6α-甲基-3，20-二酮-11β，17α-二羥基孕甾底物A的1，2位脫氫反應多採用二氯二氫苯醌為催化劑的化學脫氫法，過程的副反應較多，收率低，產生大量的難處理廢水，影響了產品質量和收率。經研究表明，採用生物法脫氫可有效控制副反應的產生，使脫氫反應收率和產品質量大幅度提高，該技術為環境友好的綠色合成技術。

發明內容本發明即是為了提供一種高純度、工藝簡單、易於工業化生產的1，4-二烯-6α-甲基-3，20-二酮-11β，17α-二羥基孕甾的生物製備方法。
為達到發明目的本發明採用的技術方案是一種1，4-二烯-6α-甲基-3，20-二酮-11β，17α-二羥基孕甾的製備方法，其特徵在於所述的方法是以4-烯-6α-甲基-3，20-二酮-11β，17α-二羥基孕甾為底物，以簡單節桿菌(Arthrobacter simplex)經發酵獲得的發酵酶液為酶源，並加入添加量為0.01～0.08g/100mL發酵酶液的維生素K3，於25～35℃下進行轉化反應36～60h，反應完全，反應液經分離純化得到所述的1，4-二烯-6α-甲基-3，20-二酮-11β，17α-二羥基孕甾。
所述發酵酶液pH值6.0～8.0，所述發酵酶液稀釋5倍後OD620值0.30～0.60。OD620值的測定方法為比濁法，即取1ml發酵液，經稀釋5倍後，以滅菌後的空白培養基作為對照，用7220分光光度計測定稀釋液的OD值，測定波長為620nm，以OD620值表示發酵液中的菌體濃度。
所述方法為將4-烯-6α-甲基-3，20-二酮-11β，17α-二羥基孕甾溶於有機溶劑中，添加到簡單節桿菌經發酵獲得的發酵酶液中進行反應，4-烯-6α-甲基-3，20-二酮-11β，17α-二羥基孕甾添加量為0.2～0.5g/100mL發酵酶液。
所述有機溶劑為下列之一甲醇、乙醇、丙酮、N，N-二甲基甲醯胺、乙酸乙酯、乙酸丁酯，所述有機溶劑體積用量為所述發酵酶液體積的3～10％(v/v)。
所述有機溶劑優選為乙醇。
所述分離純化步驟如下反應完全，反應液濾過，取濾餅用丙酮溶解後抽濾，濾液烘乾即得所述1，4-二烯-6α-甲基-3，20-二酮-11β，17α-二羥基孕甾。
具體的，所述的方法按如下在簡單節桿菌(Arthrobacter simplex)經發酵獲得的發酵酶液中按0.2～0.5g/100mL發酵酶液加入溶於乙醇的4-烯-6α-甲基-3，20-二酮-11β，17α-二羥基孕甾，乙醇的體積用量為所述發酵酶液體積的3～10％(v/v，ml/ml)，同時添加終濃度為0.01～0.08％的維生素K3，於25～35℃下進行轉化反應36～60h，反應完全，反應液經分離純化得到所述的1，4-二烯-6α-甲基-3，20-二酮-11β，17α-二羥基孕甾，所述的發酵酶液稀釋5倍後OD620值為0.30～0.60，初始pH值6.0～8.0。
所述的發酵酶液按如下方法獲得先從培養成熟的斜面上挑取簡單節桿菌Arthrobacter simplex菌苔一滿環，接種於種子培養基中，置迴轉式搖床150～200r/min，25～35℃培養8～16h得種子培養液；再取種子培養液置於產酶培養基中進行產酶培養，接種量為5～10％體積比，置迴轉式搖床於150～200r/min，25～35℃培養約12～20h，所述種子培養基組成葡萄糖0.8～1.8％；酵母膏1.0～1.8％；瓊脂2.0％；4-烯-6α-甲基-3，20-二酮-11β，17α-二羥基孕甾0.002～0.01％；pH7.0～7.2，121℃滅菌30min；所述的產酶培養基與所述的種子培養相同。除非特別指明，本發明中涉及百分比濃度均為質量體積百分比濃度(W/V)，某物質濃度為1％表示100mL溶液中含有1g該物質。
優選的，所述的方法如下
(1)種子培養種子培養基組成葡萄糖0.3～1.5％；玉米漿0.3～1.0％；蛋白腖0.1～0.8％；KH2PO40.05～0.25％；4-烯-6α-甲基-3，20-二酮-11β，17α-二羥基孕甾0.002～0.01％；pH7.0～7.2，121℃滅菌30min；接種簡單節桿菌斜面菌種，搖床轉速160r/min，28℃培養10～16h，得到pH值6.0～8.0，稀釋5倍後OD620值0.15～0.55的種子液；(2)產酶培養產酶培養基組成與種子培養基相同以體積比10％接種量接種步驟(1)所得種子液，搖床轉速180r/min，28℃培養12～20h，得到pH值6.0～8.0，稀釋5倍後OD620值0.3～0.6的發酵酶液；(3)轉化將4-烯-6α-甲基-3，20-二酮-11β，17α-二羥基孕甾溶解於乙醇中後添加至步驟(2)所得發酵酶液中，4-烯-6α-甲基-3，20-二酮-11β，17α-二羥基孕甾添加量為0.3g/100mL發酵酶液，乙醇體積用量為發酵酶液體積的7～8％，並添加0.03g/100mL發酵酶液的維生素K3，搖床轉速200r/min，32℃下反應48h；(4)反應結束後，反應液過濾取濾餅用丙酮溶解後抽濾，濾液烘乾即得所述1，4-二烯-6α-甲基-3，20-二酮-11β，17α-二羥基孕甾。
6α-甲基氫化潑尼松高效液相色譜(HPLC)檢測方法取適量樣品，加入適量乙酸丁酯，振蕩搖勻後靜置，取上層的乙酸丁酯相約1ml於試管中，烘乾。加等量流動相溶解後，過濾，待測。採用25cm的C18柱，流動相體積配比為四氫呋喃/甲醇/水＝10/20/70～30/30/40，流速0.6～1.0ml/min，紫外檢測器檢測波長為254nm，柱溫25～30℃本發明所述的1，4-二烯-6α-甲基-3，20-二酮-11β，17α-二羥基孕甾的生物製備方法的有益效果主要體現在(1)原料易得，成本低；(2)採用生物轉化法，選擇性好，工藝簡單，易於工業化生產；(3)反應條件溫和，易於分離，產物純度高。


圖1為甲基潑尼松龍標準樣品高效液相色譜分析圖；圖2為實施例1轉化物高效液相色譜分析圖；1為產物峰，2為底物峰。
具體實施方式
下面結合具體實施例對本發明進行進一步描述，但本發明的保護範圍並不僅限於此實施例11，4-二烯-6α-甲基-3，20-二酮-11β，17α-二羥基孕甾的製備斜面培養基配方為葡萄糖1.0％；酵母膏1.0％；瓊脂2.0％；pH7.0～7.2，121℃滅菌30min。
種子培養基和發酵培養基配方相同，組成為葡萄糖0.8％；玉米漿1.0％；蛋白腖0.5％；KH2PO40.20％；pH7.0～7.2，121℃滅菌30min。
從培養成熟的斜面上挑取簡單節桿菌菌苔一滿環，接種於滅菌後的裝有50ml種子培養基的250ml種子瓶中，置迴轉式搖床於160r/min，28℃培養約10～16h，經取樣檢測種子液pH值6.7，OD620值0.298。將此種子液5ml轉接至裝有50ml發酵培養基的250ml發酵瓶，置迴轉式搖床於180r/min，28℃培養約12～20h，測定菌液pH值6.7，OD620值0.343。在此發酵液內，採用有機溶劑溶解投料方式加入預先用4mL乙醇溶解的6α-甲基氫化可的松底物0.15g，並加入0.03％維生素K3，開始甾體的微生物轉化反應。轉化條件為搖床轉速200r/min，轉化溫度為32℃，轉化時間為48h。轉化結束後，料液經過濾，棄去濾液，濾餅用丙酮溶解後抽濾，濾液烘乾後得白色粉末0.13g。
6α-甲基氫化潑尼松高效液相色譜(HPLC)檢測方法分別取上述粉末樣品及6α-甲基氫化潑尼松標準品(購自浙江台州百大製藥有限公司)1m g，加入10mL的甲醇溶解，待測。採用25cm的C18柱，流動相體積配比為四氫呋喃/甲醇/水＝20/30/50，流速0.6～1.0ml/min，紫外檢測器檢測波長為254nm，柱溫25～30℃，所得色譜圖見圖1、圖2。
經檢測，產物含量為96.8％，收率為83.9％。
實例2～91，4-二烯-6α-甲基-3，20-二酮-11β，17α-二羥基孕甾的製備參照實施例1的方法，改變投料6α-甲基氫化可的松底物，pH值和OD值，結果見表1表1
實例10～151，4-二烯-6α-甲基-3，20-二酮-11β，17α-二羥基孕甾的製備參照實施例1的方法，改變投料濃度和維生素K3加量，結果見表2表2
實例16～201，4-二烯-6α-甲基-3，20-二酮-11β，17α-二羥基孕甾的製備參照實施例1的方法，採用不同有機溶劑溶解6α-甲基氫化可的松底物投料，結果見表權利要求
1.一種1，4-二烯-6α-甲基-3，20-二酮-11β，17α-二羥基孕甾的製備方法，其特徵在於所述的方法是以4-烯-6α-甲基-3，20-二酮-11β，17α-二羥基孕甾為底物，以簡單節桿菌(Arthrobacter simplex)經發酵獲得的發酵酶液為酶源，並加入添加量為0.01～0.08g/100mL發酵酶液的維生素K3，於25～35℃下進行轉化反應36～60h，反應完全，反應液經分離純化得到所述的1，4-二烯-6α-甲基-3，20-二酮-11β，17α-二羥基孕甾。
2.如權利要求1所述的1，4-二烯-6α-甲基-3，20-二酮-11β，17α-二羥基孕甾的製備方法，其特徵在於所述發酵酶液pH值6.0～8.0，所述發酵酶液稀釋5倍後OD620值0.30～0.60。
3.如權利要求2所述的1，4-二烯-6α-甲基-3，20-二酮-11β，17α-二羥基孕甾的製備方法，其特徵在於所述方法為將4-烯-6α-甲基-3，20-二酮-11β，17α-二羥基孕甾溶於有機溶劑中，再添加到簡單節桿菌經發酵獲得的發酵酶液中進行反應，4-烯-6α-甲基-3，20-二酮-11β，17α-二羥基孕甾添加量為0.2～0.5g/100mL發酵酶液。
4.如權利要求3所述的1，4-二烯-6α-甲基-3，20-二酮-11β，17α-二羥基孕甾的製備方法，其特徵在於所述有機溶劑為下列之一甲醇、乙醇、丙酮、N，N-二甲基甲醯胺、乙酸乙酯、乙酸丁酯。
5.如權利要求2所述的1，4-二烯-6α-甲基-3，20-二酮-11β，17α-二羥基孕甾的製備方法，其特徵在於所述有機溶劑體積用量為所述發酵酶液體積的3～10％。
6.如權利要求4所述的1，4-二烯-6α-甲基-3，20-二酮-11β，17α-二羥基孕甾的製備方法，其特徵在於所述有機溶劑為乙醇。
7.如權利要求3所述的1，4-二烯-6α-甲基-3，20-二酮-11β，17α-二羥基孕甾的製備方法，其特徵在於所述分離純化步驟如下反應完全，反應液過濾，取濾餅用丙酮溶解後抽濾，濾液烘乾即得所述1，4-二烯-6α-甲基-3，20-二酮-11β，17α-二羥基孕甾。
8.如權利要求1所述的1，4-二烯-6α-甲基-3，20-二酮-11β，17α-二羥基孕甾的製備方法，其特徵在於所述的方法按如下在簡單節桿菌經發酵獲得的發酵酶液中按0.2～0.5g/100mL發酵酶液加入溶於乙醇的4-烯-6α-甲基-3，20-二酮-11β，17α-二羥基孕甾，乙醇的體積用量為所述發酵酶液體積的3～10％，同時添加0.01～0.08g/100mL發酵酶液的維生素K3，於25～35℃下進行轉化反應36～60h，反應完全，反應液經分離純化得到所述的1，4-二烯-6α-甲基-3，20-二酮-11β，17α-二羥基孕甾，所述的發酵酶液稀釋5倍後OD620值為0.30～0.60，初始pH值6.0～8.0。
9.如權利要求1～8之一所述的1，4-二烯-6α-甲基-3，20-二酮-11β，17α-二羥基孕甾的製備方法，其特徵在於所述的發酵酶液按如下方法獲得先從培養成熟的斜面上挑取簡單節桿菌Arthrobactersimplex菌苔一滿環，接種於種子培養基中，置迴轉式搖床150～200r/min，25～35℃培養8～16h得種子培養液；再取種子培養液置於發酵培養基中進行發酵培養，接種量為5～10％體積比，置迴轉式搖床於150～200r/min，25～35℃培養約12～20h，所述種子培養基組成葡萄糖0.8～1.8％；酵母膏1.0～1.8％；瓊脂2.0％；4-烯-6α-甲基-3，20-二酮-11β，17α-二羥基孕甾0.002～0.01％；pH7.0～7.2，121℃滅菌30min；所述的發酵培養基與所述的種子培養相同。
10.如權利要求1所述的1，4-二烯-6α-甲基-3，20-二酮-11β，17α-二羥基孕甾的製備方法，其特徵在於所述的方法如下(1)種子培養種子培養基組成葡萄糖0.3～1.5％；玉米漿0.3～1.0％；蛋白腖0.1～0.8％；KH2PO40.05～0.25％；4-烯-6α-甲基-3，20-二酮-11β，17α-二羥基孕甾0.002～0.01％；pH7.0～7.2，121℃滅菌30min；接種簡單節桿菌斜面菌種，搖床轉速160r/min，28℃培養10～16h，得到pH值6.0～8.0，稀釋5倍後OD620值0.15～0.55的種子液；(2)發酵培養發酵培養基組成與種子培養基相同以體積比10％接種量接種步驟(1)所得種子液，搖床轉速180r/min，28℃培養12～20h，得到pH值6.0～8.0，稀釋5倍後OD620值0.3～0.6的發酵酶液；(3)轉化將4-烯-6α-甲基-3，20-二酮-11β，17α-二羥基孕甾溶解於乙醇中後添加至步驟(2)所得發酵酶液中，4-烯-6α-甲基-3，20-二酮-11β，17α-二羥基孕甾添加量為0.3g/100mL發酵酶液，乙醇體積用量為發酵酶液體積的7～8％，並添加終濃度0.03g/100mL發酵酶液的維生素K3，搖床轉速200r/min，32℃下反應48h；(4)反應結束後，反應液過濾取濾餅用丙酮溶解後抽濾，濾液烘乾即得所述1，4-二烯-6α-甲基-3，20-二酮-11β，17α-二羥基孕甾。
全文摘要
本發明提供了一種6α－甲基氫化潑尼松1，4－二烯－6α－甲基－3，20－二酮－11β，17α－二羥基孕甾的製備方法，其特徵在於所述的方法是以4－烯－6α－甲基－3，20－二酮－11β，17α－二羥基孕甾為底物，以簡單節桿菌(Arthrobacter simplex)經發酵獲得的發酵酶液為酶源，並加入添加量為0.01～0.08g/100mL發酵酶液的維生素K
文檔編號C12R1/06GK1966711SQ20061015445
公開日2007年5月23日 申請日期2006年11月1日 優先權日2006年11月1日
發明者王普, 孫新宇, 周鶯, 汪家振, 彭衛平 申請人:浙江工業大學