一種N‑琥珀醯殼聚糖固載溶菌酶製備抑菌膜的方法與流程
2023-05-02 15:53:41
本發明設計一種N-琥珀醯殼聚糖固載溶菌酶製備抑菌膜的方法，特別設計一種改性殼聚糖固載溶菌酶製備抑菌膜的方法。屬於精細化工技術領域。
背景技術：
甲殼素是自然界中僅次於纖維素的第二大類生物材料，它也是地球上除蛋白質外數量最大的含氮天然有機物。自然界每年生物合成的甲殼素估計有數十億噸之多，遠遠超過其它氨基多糖，是一種取之不盡用之不竭的再生資源。人們發現它們在紡織、印染、造紙、醫藥、食品、生物、化工、農業等眾多領域具有許多應用價值。殼聚糖是甲殼質大分子脫去乙醯基後的產物，可溶解於pH<6.5的酸性介質中，但是在中性或鹼性條件下易沉澱析出。
溶菌酶是一種廣泛存在於各種動植物有機物中的糖苷水解酶，是由129個胺基酸殘基組成的鹼性球蛋白，等電點在pH值10.8左右，分子量為14000，化學性質非常穩定。當pH值在1.2～11.3的範圍劇烈變化時，其結構幾乎不變。在酸性環境下，溶菌酶對熱的穩定性很強，pH值為4～7時，100℃處理1min仍能保持原有活性，pH值低於4時，溶菌酶可以長期在室溫下存放。
溶菌酶的作用是催化水解N-乙醯胞壁酸(N-acetylmuramic acid)和N-乙醯氨基脫氧葡萄糖(N-acetylglucosamine)間的β-1，4糖苷鍵。因為革蘭氏陽性細菌的細胞壁質主要是由胞壁質和磷酸質組成的，其中的主要成分胞壁質又是由雜多糖與多肽組成的糖蛋白，而這種多糖正是由N-乙醯胞壁酸和乙醯氨基脫氧葡萄以β-1，4糖苷鍵連結的，因此溶菌酶對革蘭氏陽性菌表現出較好的抑菌性。
為了改善殼聚糖的溶解性能，需要對其進行化學改性，例如，引入親水性的功能基團。殼聚糖分子鏈上具有活性氨基，通過將殼聚糖與琥珀酸酐反應，在氨基葡萄糖單元的N-端引入羧基，增加其在中性及鹼性水溶液中的溶解性能；其次，N-琥珀醯殼聚糖分子鏈上的活性-NH2和-COOH基團，可與多種物質共價結合，是一種非常有價值的載體。
N-琥珀酞殼聚糖(NSC)是近年來研究出的一種新型水溶性殼聚糖衍生物，由殼聚糖與琉拍酸醉酞化反應而得。殼聚糖的N-醯化反應降低了殼聚糖分子內和分子間形成氫鍵的能力，破壞了殼聚糖分子鏈原有的規整性，導致其結晶性明顯降低，所以NSC的水溶性大大提高，具有良好的生物相容性、低毒性、可以在人體內長期留滯，在琥珀醯化過程中，使得原有殼聚糖引入大量的羧基，通過EDC、NHS活化，與溶菌酶反應，實現兩者的共價結合，對金黃色葡萄球菌和李斯特菌表現出良好的抑菌性。
技術實現要素：
本發明是為解決常規殼聚糖水溶性較差的問題，因此，通過改性製備N-琥珀酞殼聚糖。為了實現溶菌酶用於食品的外包裝，將溶菌酶與成膜性較強的NSC共價連接，製備抑菌膜。製得的抑菌包裝抑菌性較強、無汙染。
本發明的技術方案由以下部分組成。
(1)製備NSC：殼聚糖粉末按照1：18-1：22(mg/mL)溶解在DMSO中，緩慢加入琥珀酸酐，使得殼聚糖與琥珀酸酐的質量比為1～3，在50-70℃加熱6-8h。過濾，將沉澱物溶解在乙醇中，用1MNaOH溶液調節溶液pH為9-12。過濾後將沉澱物按照1：50～55(mg/mL)溶解在蒸餾水中，再加入丙酮，丙酮與蒸餾水的質量比為3～5，用乙醇和丙酮衝洗沉澱，將獲得的產物在50℃真空條件下乾燥。
(2)NSC固載溶菌酶：取1gNSC溶解在20-50mLpH為4-7的檸檬酸磷酸緩衝液中，加入EDC、NHS，溶菌酶製得所需溶液。
(3)抑菌膜的製備：將上述製得的液體採用流涎法制膜，加入0％-9％的甘油，在30℃條件下乾燥5-13h。
本發明製得的NSC水溶性好，易於實現與溶菌酶的共價結合，製得的抑菌膜對金黃色葡萄球菌、李斯特菌的抑菌性較好，易溶於水溶液。整個操作過程簡便易行，製得的膜結構緻密，表面光滑，無毒無害。
下面結合實例對本發明內容進行描述。
附圖說明
圖1為本發明製得的NSC的核磁共振圖；
圖2為本發明製得的NSC的X-衍射圖；
圖3為本發明製得的NSC的紅外光譜圖；
圖4、5為本發明製得的抑菌膜電鏡掃描照片；
圖6為本發明製得的抑菌膜紅外光譜圖；
圖7為本發明製得的抑菌膜圓二色譜圖；
圖8為發明製得的抑菌膜對李斯特的抑菌性照片；
圖9為發明製得的抑菌膜對金黃色葡萄球菌的抑菌性照片；
具體實施例
下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，實施例僅用於說明本發明而不用於限制本發明的範圍。
實施例1
稱取3g殼聚糖粉末加入到63mL的DMSO中混合，緩慢加入7.5g琥珀酸酐，在60℃條件下反應7h，過濾溶液，在室溫下將沉澱物溶解在乙醇中，在室溫下反應2h。用1M NaOH調節溶液的pH為10，過濾，將沉澱物溶解在140mL的蒸餾水中。再加入420mL丙酮，分別用乙醇和丙酮衝洗沉澱3次，將獲得的產物在50℃真空條件下乾燥24h。
稱取1.0gNSC溶解在20mL的pH＝5的檸檬酸磷酸緩衝液中，分別加入0.02gEDC、NHS，在室溫下攪拌2h，然後加入0.05g溶菌酶，攪拌2h，然後加入質量分數7％的甘油，採用流涎法制膜，在30℃條件下乾燥7h，掀膜。通過抑菌試驗檢測其抑菌性。
測得所對應添加溶菌酶量為2500ug/mL、1250ug/mL的膜液對李斯特的抑菌圈分別為15mm、11mm，對金黃色葡萄球菌的抑菌圈分別為20mm、14mm。
實施例2
稱取3g殼聚糖粉末加入到63mL的DMSO中混合，緩慢加入7.5g琥珀酸酐，在60℃條件下反應7h，過濾溶液，在室溫下將沉澱物溶解在乙醇中，在室溫下反應2h。用1M NaOH調節溶液的pH為10，過濾，將沉澱物溶解在140mL的蒸餾水中。再加入420mL丙酮，分別用乙醇和丙酮衝洗沉澱3次，將獲得的產物在50℃真空條件下乾燥24h。
稱取1.0gNSC溶解在20mL的pH＝6的檸檬酸磷酸緩衝液中，分別加入0.02gEDC、NHS，在室溫下攪拌2h，然後加入0.05g溶菌酶，攪拌2h，然後加入質量分數7％的甘油，採用流涎法制膜，在30℃條件下乾燥7h，掀膜。通過抑菌試驗檢測其抑菌性。
測得所對應添加溶菌酶量為2500ug/mL、1250ug/mL的膜液對李斯特不表現出抑菌性，對金黃色葡萄球菌的抑菌圈分別為14mm、11mm。
實施例3
稱取3g殼聚糖粉末加入到63mL的DMSO中混合，緩慢加入7.5g琥珀酸酐，在60℃條件下反應7h，過濾溶液，在室溫下將沉澱物溶解在乙醇中，在室溫下反應2h。用1M NaOH調節溶液的pH為10，過濾，將沉澱物溶解在140mL的蒸餾水中。再加入420mL丙酮，分別用乙醇和丙酮衝洗沉澱3次，將獲得的產物在50℃真空條件下乾燥24h。
稱取1.0gNSC溶解在20mL的pH＝7的檸檬酸磷酸緩衝液中，分別加入0.02gEDC、NHS，在室溫下攪拌2h，然後加入0.05g溶菌酶，攪拌2h，然後加入質量分數7％的甘油，採用流涎法制膜，在30℃條件下乾燥7h，掀膜。通過抑菌試驗檢測其抑菌性。
測得所對應添加溶菌酶量為2500ug/mL、1250ug/mL的膜液對李斯特、金黃色葡萄球菌不表現出抑菌性。