一種單鏈抗體及其在檢測黃麴黴毒素中的應用的製作方法

2023-05-03 04:09:41

專利名稱：一種單鏈抗體及其在檢測黃麴黴毒素中的應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種單鏈抗體及其在檢測黃麴黴毒素中的應用
背景技術：
黃麴黴毒素(Af latoxin, AFT)是一種對人類健康和農業生產都具有巨大威脅的真菌毒素，其化學結構類似，均為二氫呋喃香豆素的衍生物，分子量約為312-346，是由黃麴黴(Aspergillus flavus)寄生麴黴(A. parasiticus)產生的次生代謝產物。全世界每年死於真菌毒素誘發癌症的人多達25萬。真菌毒素的汙染也導致大量農產品被銷毀，每年造成的經濟損失達數億美元。在溼熱地區食品和飼料中出現黃麴黴毒素的機率最高。黃麴黴毒素是一種毒性極強的劇毒物質，對人及動物肝臟組織有破壞作用，嚴重時可導致肝癌甚至死亡。1993年黃麴黴毒素被世界衛生組織(WHO)的癌症研究機構劃定為I類致癌物。目前已分離鑑定出的黃麴黴毒素達20餘種，主要包括B1, B2, G1, G2, M1, M2,P1, Q，H1, GM, B2a和毒醇等。在天然汙染的食品中以黃麴黴毒素B1最為多見，其毒性和致癌性也最強。由於黃麴黴毒素的巨大毒性，已有70多個國家和地區對食品中AFT的含量作了限量要求。2006年WHO食品法典委員會推薦食品、飼料中黃麴黴毒素最大允許量標準為總量(AFB1、AFB^AFG1、AFG2的總和)小於15 u g/kg ;牛奶中AFM1的最大允許量為0. 5 y g/kg。歐盟於2008年重新評估了真菌毒素在穀物和穀物製品中的水平，制定了更為嚴格的上限標準AFB1限量g/kg，AFT總量限量g/kg。我國衛生部於1990年11月發布了《防止黃麴黴毒素汙染食品衛生管理辦法》，規定不同類樣本中AFB1的限量為5-204 y g/kg。AFT的定量測定方法分為兩大類。一類是建立在色譜基礎上的理化分析方法，其中包括了應用螢光檢測的薄層色譜法(TLC)、液相色潛法(LC)、高效液相色譜法(HPLC)以及液相-質譜連用檢測(LC-MASS)。另一類為免疫化學法，如放射免疫測定法(RIA)和酶聯免疫分析法(ELISA)。上述檢測技術中，免疫學方法，尤其是ELISA技術由於其快速、低成本、適合大量樣本的高通量檢測等特點被越來越廣泛的應用於黃麴黴毒素分析檢測領域。目前國內酶聯免疫法試劑盒所用的抗體主要還是多克隆抗體和單克隆抗體。這兩種抗體製備技術成本高昂，產量有限，極大地限制了免疫學方法在檢測中的進一步發展。

發明內容
本發明的目的是提供一種單鏈抗體及其在檢測黃麴黴毒素中的應用。本發明提供的單鏈抗體，是由輕鏈可變區、連接肽和重鏈可變區組成的多肽；所述連接肽位於所述輕鏈可變區與所述重鏈可變區之間；所述輕鏈可變區如序列表的序列I自N末端第I至110位胺基酸殘基所示；所述重鏈可變區如序列表的序列I自N末端第131至248位胺基酸殘基所示。所述連接肽可如序列表的序列I自N末端第111至130位胺基酸殘基所示。所述單鏈抗體具體可為序列表的序列I所示的多肽或序列表的序列4所示的多肽。
本發明還保護編碼所述單鏈抗體的基因，由所述輕鏈可變區的編碼序列、所述連接肽的編碼序列和所述重鏈可變區的編碼序列組成。所述輕鏈可變區的編碼序列可如序列表的序列2自5』末端第9至338位核苷酸所示。所述重鏈可變區的編碼序列可如序列表的序列2自5』末端第399至752位核苷酸所示。所述連接肽的編碼序列可如序列表的序列2自5』末端第339至398位核苷酸所
/Jn o所述基因具體可為如下(a)或(b): (a)序列表的序列2自5』末 端第9至752位核苷酸所示的DNA分子；(b)序列表的序列2自5』末端第9至791位核苷酸所示的DNA分子。含有所述基因的表達盒、重組載體、重組菌或轉基因細胞系均屬於本發明的保護範圍。所述重組載體具體可為將所述基因插入pET_22b(+)質粒得到的重組質粒，更具體可為將所述基因插入pET-22b(+)質粒的NcoI和XhoI酶切位點之間得到的重組質粒。所述重組菌具體可為將所述重組質粒導入大腸桿菌得到的重組菌，更具體可為將所述重組質粒導入大腸桿菌BL21 (DE3)菌株得到的重組質粒。本發明還保護一種製備所述單鏈抗體的方法，是發酵培養所述重組菌，得到所述單鏈抗體。所述方法具體包括如下步驟(I)將所述重組菌培養至0D600=1. 0時加入IPTG並使其濃度為0. 5mM，然後25°C、250rpm振蕩培養8小時，離心收集菌體沉澱；(2)將步驟(I)得到菌體進行細胞破碎，離心收集上清液；(3)將步驟(2)得到的上清液依次進行透析和濃縮，得到單鏈抗體溶液。本發明還保護以上任一所述單鏈抗體在檢測黃麴黴毒素中的應用。所述黃麴黴毒素具體可為AFB1 (黃麴黴毒素B1X AFB2 (黃麴黴毒素B2)、AFM1 (黃麴黴毒素M1XAFM2 (黃麴黴毒素M2)、AFG1 (黃麴黴毒素G1)或AFG2 (黃麴黴毒素G2)。所述單鏈抗體具體可為採用以上所述方法製備得到的單鏈抗體。重組抗體是新發展起來的第三代抗體製備技術，通過對抗體文庫的高效篩選，可以獲得特性優良的抗體片段。通過高效的表達系統表達該抗體片段，可以低成本、大量製備該抗體片段。本發明針對目前單克隆抗體和多克隆抗體的不足，以AFM1特異性單抗雜交瘤為來源，製備單鏈抗體(scFv)，並採用蛋白質體外進化技術和噬菌體展示抗體庫技術對其進行性能優化，提高其親和力及對不同AFT的交叉反應率。本發明提供的單鏈抗體對多種黃麴黴毒素具有良好的交叉反應率、高親和力和高靈敏度，適用於多種多殘留黃麴黴毒素的快速免疫檢測，將在黃麴黴毒素檢測中發揮重大作用。


圖I為黃麴黴毒素scFv空間結構模型；A: scFv主鏈結構示意圖；B:SCFv溶液可及表面圖；紅色為HCDRs，藍色為IXDRs。圖2為scFv與AFM1的相互作用計算機模擬；A =AFM1結合部位(黃色為HCDR3，橙色為HCDR2，紅色為HCDR3，藍色為IXDR3) ；B :抗原抗體相互作用2D示意圖(紫紅色為產生極性接觸的胺基酸殘基，綠色為產生非極性接觸的胺基酸殘基，藍色虛線為氫鍵作用)。圖3為採用黃麴黴毒素B1製作的曲線圖。
具體實施例方式以下的實施例便於更好地理解本發明，但並不限定本發明。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為自常規生化試劑商店購買得到的。以下實施例中的定量試驗，均設置三次重複實驗，結果取平均值。AFBi (黃麴黴毒素B1XAFMi (黃麴黴毒素M1XAFM2 (黃麴黴毒素M2)、AFB2 (黃麴黴毒
(黃麴黴毒素G1)和AFG2 (黃麴黴毒素G2)均購自美國Sigma公司。實施例中所用的PBS緩衝液，如無特殊說明，均為pH7. 4,0. OlM的PBS緩衝液。實施例中所用的碳酸鹽緩衝液均為pH9. 6,0. 05mol/L的碳酸鈉緩衝液。牛血清白蛋白簡稱BSA。N，N-二甲基甲醯胺(DMF)如式(I )所示。
權利要求
1.一種單鏈抗體，是由輕鏈可變區、連接肽和重鏈可變區組成的多肽；所述連接肽位於所述輕鏈可變區與所述重鏈可變區之間；所述輕鏈可變區如序列表的序列I自N末端第I至110位胺基酸殘基所示；所述重鏈可變區如序列表的序列I自N末端第131至248位胺基酸殘基所示。
2.如權利要求I所述的單鏈抗體，其特徵在於所述連接肽如序列表的序列I自N末端第111至130位胺基酸殘基所示。
3.如權利要求2所述的單鏈抗體，其特徵在於所述單鏈抗體為序列表的序列I所示的多肽或序列表的序列4所示的多肽。
4.編碼權利要求I所述單鏈抗體的基因，由所述輕鏈可變區的編碼序列、所述連接肽的編碼序列和所述重鏈可變區的編碼序列組成。
5.如權利要求4所述的基因，其特徵在於所述輕鏈可變區的編碼序列如序列表的序列2自5』末端第9至338位核苷酸所示；所述重鏈可變區的編碼序列如序列表的序列2自5』末端第399至752位核苷酸所示。
6.如權利要求5所述的基因，其特徵在於所述連接肽的編碼序列如序列表的序列2自5』末端第339至398位核苷酸所示。
7.如權利要求6所述的基因，其特徵在於所述基因為如下(a)或(b) Ca)序列表的序列2自5』末端第9至752位核苷酸所示的DNA分子； (b)序列表的序列2自5』末端第9至791位核苷酸所示的DNA分子。
8.含有權利要求4至7中任一所述基因的表達盒、重組載體、重組菌或轉基因細胞系。
9.製備權利要求I至3中任一所述單鏈抗體的方法，是發酵培養權利要求8所述重組菌，得到所述單鏈抗體。
10.權利要求I至3中任一所述單鏈抗體在檢測黃麴黴毒素中的應用。
全文摘要
本發明公開了單鏈抗體及其在檢測黃麴黴毒素中的應用。本發明提供的單鏈抗體，是由輕鏈可變區、連接肽和重鏈可變區組成的多肽；所述連接肽位於所述輕鏈可變區與所述重鏈可變區之間；所述輕鏈可變區如序列表的序列1自N末端第1至110位胺基酸殘基所示；所述重鏈可變區如序列表的序列1自N末端第131至248位胺基酸殘基所示。本發明提供的單鏈抗體對多種黃麴黴毒素具有良好的交叉反應率、高親和力和高靈敏度，適用於多種多殘留黃麴黴毒素的快速免疫檢測，將在黃麴黴毒素檢測中發揮重大作用。
文檔編號G01N33/577GK102653558SQ201210160699
公開日2012年9月5日 申請日期2012年5月22日 優先權日2012年5月22日
發明者丁雙陽, 史為民, 吳聰明, 張素霞, 江海洋, 沈建忠, 溫凱, 王戰輝 申請人:中國農業大學