檢測清開靈注射液中高分子量物質的凝膠色譜測定方法

2023-09-11 12:41:35 5

專利名稱：檢測清開靈注射液中高分子量物質的凝膠色譜測定方法
技術領域：
本發明涉及中藥注射液檢測技術領域，具體涉及一種檢測清開靈注射液中高分子量物質的凝膠色譜測定方法。
背景技術：
高分子物質研究是本探索性研究的主要內容，清開靈注射液中的不良反應較多， 文獻報導的焦點多數是有關高分子量等大分子物質。由於方法的限制，這類高分子量的測定一直沒有開展。含有高分子量物質的清開靈注射液產品，從安全性角度考慮，患者在應用時需要進行皮試試驗。但是皮試試驗僅能對速髮型I型變態反應有預測作用，且陽性符合度僅30%，即使皮試試驗呈陰性也不能說明以後不發生過敏反應，臨床可能出現的變態反應還有II、III、IV型變態反應，這是皮試試驗無法預測的。因此，為了確保臨床用藥的安全有效，對清開靈注射液產品中高分子量物質的含量進行檢測，對可能帶入的高分子量物質進行有效地監控，從源頭上控制臨床過敏反應的發生，既可以節約寶貴的臨床急救時間，同時也增加了臨床醫護人員與患者的便利性，減輕了患者的用藥痛苦，具有非常重要的意義。故有必要設計一款新的凝膠色譜測定方法來彌補這些缺陷。

發明內容
本發明要解決的技術問題是克服現有技術中的缺陷，提供一種簡便易行、耗費少、 時間短、準確性和重現性都很好的檢測清開靈注射液中高分子量物質的凝膠色譜檢測方法。為達到上述目的，本發明提供一種檢測清開靈注射液中高分子量物質的凝膠色譜測定方法，該方法包括下列步驟a、對照溶液的製備取核糖核酸酶A、人胰島素、胸腺素 α、人生長激素釋放抑制因子對照品溶液各1ml，置25ml量瓶中，加水稀釋並定容至刻度， 即得對照品溶液I ；再取對照溶液I 2. 5ml，定容至25ml，即得對照溶液II ；b、供試品溶液的製備取供試品溶液10ml，至20ml的超濾離心管中，在10000轉/min離心15分鐘，取殘留物加水定容至1ml，即得；C、測定法分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各20μ 1，注入液相色譜儀，以各對照品的分子量(MW)的對數與其相應保留時間(tR)製得標準曲線的線性回歸方程IogMW = a+b tR，再由標準曲線回歸方程分別計算分子量為10000,5000及 1000物質的保留時間，以此為限即可計算供試品在各段的累計峰面積值；d、測量最低檢出限取對照溶液II分別依次進樣25μ 1、20μ 1、15μ 1、10μ 1、5μ 1，可發現在進樣10μ 1核糖核酸酶A的峰高與基線噪音的比例約為3 1，即得最低檢出限；e、檢測樣品基質幹擾的影響分別取對照品溶液II 2ml,3ml,4ml置於5ml量瓶中，用清開靈注射液分別稀釋至刻度，依次進樣25 μ 1測試，檢測樣品基質對檢測靈敏度的幹擾；f、模擬試驗模擬水牛角粉、 珍珠母粉的提取工藝，分別在水解2、4、6、8小時取樣，檢測水解過程中特異蛋白的存在；g、 樣品的測定採用供試品溶液的製備方法對10批樣品進行檢測，注射液的生產工藝控制截取保留相對分子量6000以下的有效物質。
上述步驟中高效液相色譜的條件為色譜柱為凝膠色譜柱TSK G2000 Sffxl柱；流動相為乙腈-0. 83%三氟乙酸溶液；檢測波長為214士 Inm ；流速0. 70 0. 75ml/min。所述供試品溶液色譜圖中，選用體積排除色譜先於分子量5800的保留時間的峰作為高分子量物質的峰，按面積歸一化法計算，含高分子量物質的量< 1. 0%。測定過程中所述三氟乙酸溶液作為分析純，所述乙腈作為色譜純。葡聚糖凝膠法測定蛋白質分子量的原理，主要是依據凝膠具有分子篩作用，一定型號的凝膠具有大體上一定大小的孔徑。當樣品流經凝膠柱時，大於孔隙的大分子完全不滲入到凝膠內部，很快流出，體積小於孔隙的大分子，則將通過凝膠流出，因此流出較慢。假定蛋白質分子近於球形，同時沒有顯著的水合作用，則不同大小分子量的蛋白質，進入凝膠篩孔的程度不同，其洗脫體積決定於分子大小。當蛋白質分子量在一定範圍內，蛋白質在葡聚糖凝膠柱上層析的洗脫體積和分子量的對數呈直線關係。本發明的優點在於本發明檢測清開靈注射液中高分子量物質的凝膠色譜測定方法經方法學驗證，該方法的靈敏度可達到ppm級，能有效鑑別水牛角及珍珠母中不能完全水解的高分子物質或高分子量，是一種準確、可靠的高分子檢查方法。利用所建立的方法對6個企業的18批樣品進行了排查，結果樣品中可測出分子量在5800以上的成分。本發明簡便易行、耗費少、時間短、準確性和重現性都很好，可以確保臨床用藥的安全有效，對清開靈注射液產品中高分子量物質的含量進行檢測，對可能帶入的高分子量物質進行有效地監控，從源頭上控制臨床過敏反應的發生，既可以節約寶貴的臨床急救時間，同時也增加了臨床醫護人員與患者的便利性，減輕了患者的用藥痛苦，具有非常重要的意義。本發明採用TSK G2000 SWxl型凝膠柱對清開靈注射液中的高分子物質進行檢測，結果在進樣體積 20 μ 1，檢出限為0. 08 μ g下能檢出大分子物質，說明本發明建立了一套完整的高分子物質檢測方法。


附圖1為本發明對照溶液與樣品混合色譜圖；附圖2為本發明最低檢出限色譜圖；附圖3為本發明分子量對數IgM-出峰時間曲線；附圖4為本發明珍珠母提取液的光譜圖；附圖5為本發明水牛角提取液的光譜圖。
具體實施例方式下面結合說明書附圖，對本發明做進一步說明。優選的，一種檢測清開靈注射液中高分子量物質的凝膠色譜測定方法，該方法包括下列步驟a、對照溶液的製備如圖1所示，取核糖核酸酶A、人胰島素、胸腺素α、人生長激素釋放抑制因子對照品溶液各1ml，置25ml量瓶中，加水稀釋並定容至刻度，即得對照品溶液I ；再取對照溶液I 2. 5ml，定容至25ml，即得對照溶液II ；b、供試品溶液的製備取供試品溶液10ml，至20ml的超濾離心管中，本發明採用Millipore超濾離心管，在10000轉 /min離心15分鐘，取殘留物加水定容至1ml，即得供試品溶液；C、測定法分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各20μ 1，注入液相色譜儀，以各對照品的分子量(MW)的對數與其相應保留時間(tR)製得標準曲線的線性回歸方程IogMW = a+b tR，再由標準曲線回歸方程分別計算分子量為10000,5000及1000物質的保留時間，以此為限即可計算供試品在各段的累計峰面積值；d、測量最低檢出限如圖2所示，取對照溶液II分別依次進樣25μ 1、 20μ 1、15μ 1、10μ 1、5μ 1，可發現在進樣10 μ 1核糖核酸酶A的峰高與基線噪音的比例約為3 1，即得最低檢出限為0.04 μ g;e、檢測樣品基質幹擾的影響分別取對照品溶液II 2ml,3ml,4ml置於5ml量瓶中，用清開靈注射液分別稀釋至刻度，依次進樣25 μ 1測試，檢測樣品基質對檢測靈敏度的幹擾；f、模擬試驗如圖4和圖5所示，模擬水牛角粉、珍珠母粉的提取工藝，分別在水解2、4、6、8小時取樣，檢測水解過程中特異蛋白的存在；g、樣品的測定採用供試品溶液的製備方法對10批樣品進行檢測，注射液的生產工藝控制截取保留相對分子量6000以下的有效物質。上述步驟中高效液相色譜的條件為色譜柱為凝膠色譜柱TSK G2000 Sffxl柱；流動相為乙腈-0.83%三氟乙酸溶液GO 60)；檢測波長為214士 Inm;流速0.70 0.75ml/ min0所述供試品溶液色譜圖中，選用體積排除色譜先於分子量5800的保留時間的峰作為高分子量物質的峰；測定過程中所述三氟乙酸溶液作為分析純，所述乙腈作為色譜純。本發明實施例的具體操作步驟為1、最低檢出限取對照品溶液II分別依次進樣 25μ 1、20μ 1、15μ 1、10μ 1、5μ 1，可發現在進樣10 μ 1核糖核酸酶A的峰高與基線噪音的比例約為3 1，即得最低檢出限為0.08yg。2、樣品基質幹擾的影響分別取對照品溶液 II 2ml,3ml,4ml置5ml量瓶中，用清開靈注射液分別稀釋至刻度，依次進樣25 μ 1，依法測試，結果此時能檢出的限度為0. 16 μ g。這說明由於樣品基質的幹擾使檢測靈敏度降低一半。3、分子量對數與出峰時間曲線由最低檢出限中的各對照出峰時間及其分子量(見表 1)，可繪製分子量對數-出峰時間曲線，見圖3。以各對照品的分子量(MW)的對數與其相應保留時間(tR)製得標準曲線的線性回歸方程IogMW = M. 71-3. 412 tR，再由標準曲線回歸方程計算分子量為10000、5000及1000物質的保留時間分別為11. 06minU2. 09min及 14. 49min,以此為限即可計算供試品在各段的累計峰面積值。4、準確度和重複性試驗取同一批參芪扶正注射液IOmL於20ml的超濾離心管中，共6份，再加入ImL對照品溶液I， 在10000轉/min離心15-20分鐘，取殘留物加水定容至1ml，即得供試品溶液。取上述供試品溶液和對照品溶液I各20μ 1，進樣測定。根據供試品溶液與對照品溶液中核糖核酸酶A 與人胰島素的峰面積比值，計算回收率。結果表明核糖核酸酶A的平均回收率約為90%， RSD (n = 6)為4. 33% ；人胰島素的平均回收率約為72%，RSD (n = 6)為5. 86%，說明該方法對以上兩種成分測定的準確度和重複性良好。由於本超濾離心管的截流分子量為10000， 人胰島素分子量為5800，這可能是回收率偏低的原因。由於胸腺素α和人生長激素釋放抑制因子分子量較小且樣品基質幹擾明顯，故未能計算兩者的回收率。表1為由最低檢出限中的各對照出峰時間及其分子量，可繪製分子量對數-出峰時間曲線，如圖3所示。表1 各對照品分子量及出峰時間
權利要求
1.檢測清開靈注射液中高分子量物質的凝膠色譜測定方法，其特徵在於該方法包括下列步驟a、對照溶液的製備取核糖核酸酶A、人胰島素、胸腺素α、人生長激素釋放抑制因子對照品溶液各1ml，置 25ml量瓶中，加水稀釋並定容至刻度，即得對照品溶液I ；再取對照溶液I 2. 5ml，定容至 25ml，即得對照溶液II ；b、供試品溶液的製備取供試品溶液10ml，至20ml的超濾離心管中，在10000轉/min離心15分鐘，取殘留物加水定容至1ml，即得；C、測定法分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各20μ 1，注入液相色譜儀，以各對照品的分子量(MW)的對數與其相應保留時間(tR)製得標準曲線的線性回歸方程IogMW = a+b tR，再由標準曲線回歸方程分別計算分子量為10000，5000及1000物質的保留時間，以此為限即可計算供試品在各段的累計峰面積值；d、測量最低檢出限取對照溶液II分別依次進樣25μ 1、20μ 1、15μ 1、10μ 1、5μ 1，可發現在進樣10μ 1核糖核酸酶A的峰高與基線噪音的比例約為3 1，即得最低檢出限；e、檢測樣品基質幹擾的影響分別取對照品溶液II 2ml,3ml,4ml置於5ml量瓶中，用清開靈注射液分別稀釋至刻度，依次進樣25 μ 1測試，檢測樣品基質對檢測靈敏度的幹擾；f、模擬試驗模擬水牛角粉、珍珠母粉的提取工藝，分別在水解2、4、6、8小時取樣，檢測水解過程中特異蛋白的存在；g、樣品的測定採用供試品溶液的製備方法對10批樣品進行檢測，注射液的生產工藝控制截取保留相對分子量6000以下的有效物質。
2.如權利要求1所述的檢測清開靈注射液中高分子量物質的凝膠色譜測定方法，其特徵在於所述高效液相色譜的條件為色譜柱為凝膠色譜柱TSK G2000SWxl柱；流動相為乙腈-0.83%三氟乙酸溶液GO 60)；檢測波長為214士 Inm;流速0. 70 0. 75ml/min。
3.如權利要求1所述的檢測清開靈注射液中高分子量物質的凝膠色譜測定方法，其特徵在於所述供試品溶液色譜圖中，選用體積排除色譜先於分子量5800的保留時間的峰作為高分子量物質的峰。
4.如權利要求1至3中任一項中所述的檢測清開靈注射液中高分子量物質的凝膠色譜測定方法，其特徵在於測定過程中所述三氟乙酸溶液作為分析純，所述乙腈作為色譜純。
全文摘要
本發明提供一種檢測清開靈注射液中高分子量物質的凝膠色譜測定方法，該方法包括下列步驟a、對照溶液的製備；b、供試品溶液的製備；c、測定法分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各20μl，注入液相色譜儀，以各對照品的分子量的對數與其相應保留時間製得標準曲線的線性回歸方程，再由標準曲線回歸方程分別計算分子量為10000，5000及1000物質的保留時間，以此為限即可計算供試品在各段的累計峰面積值；d、測量最低檢出限；e、檢測樣品基質幹擾的影響；f、模擬試驗；g、樣品的測定。本發明的方法對清開靈注射液產品中的高分子量物質進行檢測，對可能帶入的高分子量物質進行有效地監控，具有非常重要的意義。
文檔編號G01N30/02GK102175779SQ20101059515
公開日2011年9月7日 申請日期2010年12月17日 優先權日2010年12月17日
發明者劉瀟瀟, 李泳雪, 楊立偉, 肖樹雄, 胡珂 申請人:廣東省藥品檢驗所