一種培養敏感細胞生產藍耳病疫苗的方法
2023-09-19 03:29:45 1
專利名稱：一種培養敏感細胞生產藍耳病疫苗的方法
技術領域：
本發明涉及培養細胞生產疫苗的方法，特別是涉及一種培養敏感細胞生產 藍耳病疫苗的方法。
背景技術：
藍耳病，是豬繁殖與呼p及綜合4正病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV)感染所引起的一種接觸性傳染病。各種日齡的豬只 均可感染，臨床上主要表現為母豬繁殖障礙和仔豬的呼吸症狀。母豬的繁殖障 礙可表現為流產、死產和弱仔，生後仔豬的死淘率增加；哺乳仔豬的呼吸道症 狀主要表現為高熱、呼吸困難等肺炎的症狀。該病目前尚無特效藥物療法，主 要採取疫苗強制免疫的辦法。
目前，藍耳病疫苗的生產主要是通過轉瓶培養Marc145細胞並增殖豬繁殖 與呼吸症候群病毒的工藝進行生產。該方法自動化程度低，勞動強度大，並因 為轉瓶細胞培養環境的不可控性，導致細胞和藍耳病疫苗質量不穩定，產品批 次差異大。
發明內容
為了克服現有藍耳病疫苗的生產技術所存在的缺陷，實現簡便、高效的生 產藍耳病疫苗，發明人經過研究，提供了一種培養敏感細胞生產藍耳病疫苗的 方法。該方法應用^f敬載體培養技術在生物反應器中培養^:感細胞來生產藍耳病 疫苗。因為微載體提供了更大的表面積，細胞可以生長到更高的細胞密度，而 生物反應器的自動控制培養環境參數，使得細胞生長和病毒繁殖處於較優的環 境，提高了病毒滴度，疫苗質量也更加穩定。
在本發明的一個方面中，提供了一種培養敏感細胞生產藍耳病疫苗的方 法，其包括以下步驟
1) 用微載體培養敏感細胞；
2) 在微載體培養的所述敏感細胞上接種豬繁殖與呼吸症候群病毒；3) 繼續培養所述敏感細胞；
4) 收穫病毒液，生產藍耳病疫苗。
在本發明的一個實施方式中，步驟l)用微載體培養敏感細胞是按以下過
程進行的將微載體經清洗和高溫滅菌之後，接種所述敏感細胞，接著培養細 胞到細胞密度為3 x 106-10 x 106 cells/ml,此時微載體上的細胞形成健康、致 密的單層，有利於藍耳病病毒的吸附、感染並在細胞上實現增殖。優選的細胞 密度為5 x 106 cells/ml左右，過高的細胞密度容易導致營養不夠，過低的細胞 密度則無法實現微載體培養達到高密度的優點，生產成本增加。
優選地，所述培養細胞採用灌注培養方式。細胞灌注培養是指在細胞培養 過程中，往生物反應器中不斷地流加新鮮培養基，同時通過細胞截留裝置排出 培養上清，而活細胞被繼續截留在生物反應器中的一種培養操作方式。培養基 的不斷流出，可帶走代謝副產物如乳酸、氨等，使其維持在低濃度水平，不會 成為細胞生長的抑制因素，所以細胞可生長在良好培養環境中，能獲得很高的 細胞培養密度和產物生產速率。灌注培養具有反應器體積小，回收培養上清體 積大，產品在罐內停留時間短，可及時回收產品至低溫下保存，有利於保持產 品活性等顯著特點。
優選地，在本實施方式中，該灌注培養方式可以釆用以下過程進行在生 物反應器中，微載體用PBS衝洗、浸泡幾遍，高壓滅菌後，往生物反應器中 接種敏感細胞，待細胞生長至l-2xl0乞ells/ml的細胞密度後，進行灌注培養， 每天的灌注速率為0.5-3個培養體積，隨著細胞密度的提高，逐步提高灌注速 率，直到反應器中的活細胞密度達到3-10xl06cells/ml。
在本發明的另一實施方式中，優選地，在步驟2)中，按病毒感染複數 MOI為0.01 - 0.5的量接種所述豬繁殖與呼吸症候群病毒。敏感細胞感染合適 的藍耳病毒數量，有利於病毒在細胞上的複製和增殖。本發明考慮到工業化生 產所需要的穩定的種子PRRSV病毒來源以及本發明的實踐結果，更優選MOI 在0.01-0.2。其中豬繁殖和呼吸綜合症病毒PRRSV，無論是歐洲型還是美洲型， 強毒抹還是弱毒株，對Marc145細胞和MA104細胞普遍具有適應性和敏感性， 所以本發明所闡述的方法適用於所有PRRSV毒抹。
在本文中，術語"病毒感染複數MOI (multiplicity of infection)"是指每一個細胞上所感染病毒的數量。MOI =有感染力的病毒量/細胞總量。
在本發明的另一實施方式中，步驟3)中所述繼續培養所述敏感細胞採用 流加培養或灌注培養方式，維持pH在6.9-7.3的範圍和病毒繁殖所需要的營 養條件。在病毒感染敏感細胞一段時間後，比如6-18hr後，可以採用流加培 養或者灌注培養等方式往生物反應器中添加病毒維持液，維持合適的pH值(比 如6.9-7.3)和營養成份，不斷收穫上清病毒液。
在本發明的另一實施方式中，步驟4)可以採用各種方法來製備疫苗。比 如，可以將所收穫的病毒液^:置於2-8。C中，並保存在-2(TC，凍融l次，過 濾、滅活、乳化後製備疫苗。
在本發明中，所用的敏感細胞可以是任何適宜培養豬繁殖與呼吸症候群病 毒的細胞，優選地，所述敏感細胞選自Marc 145細胞或MA 104細胞，其中 Marc 145是MA 104克隆後的細胞。
優選地，本發明方法是在生物反應器中進行的。在本發明中，所採用的生 物反應器包括但不限於攪拌式生物反應器、氣升式生物反應器、wave生物反 應器和中空纖維反應器等。
在本發明的各種實施方式中，所選用的培養基、微載體等具體構成並不是 關鍵的，原則上所有能夠用於培養所用的敏感細胞和豬繁殖與呼吸症候群病毒 的培養基和微載體都可以使用。很多培養基和微載體都已經是商業化產品，可 以通過商業途徑獲得。
本發明的前述及其他特徵將在下文中更全面進行描述並在權利要求中特 別指出，以下說明書詳細闡述本發明的一些示例實施方式，不過，這些實施方 式只是表示本發明的原則可以被使用的幾個不同的方式。參見下面優選的實施 方式，本發明的其他優點和特徵對於本領域技術人員來說是顯而易見的。
圖1顯示了 50升反應器中微載體培養Marc145細胞的細胞生長曲線。
具體實施例方式
本發明方法的優選實施方式為
在生物反應器中，微載體用PBS衝洗、浸泡幾遍，高壓滅菌後，往生物 反應器中接種敏感細胞，細胞生長至l-2xl06cdls/ml的細胞密度後進行灌注培養，待活細胞密度達到3-10xl06cells/ml後，加入病毒液，按病毒感染複數 MOI-0.01-0.5 (優選MOI = 0.01 - 0.2 )的量，在微載體培養的敏感細胞上接 種豬繁殖與呼吸症候群病毒，病毒感染6-18hr後，通過流加培養或灌注培養 的方式維持病毒繁殖所需要的營養條件和6.9-7.3的pH值，從第1-3天起收穫 病毒液，收穫病毒液經-20。C凍融後測定收穫液的TCID5。/ml,並用於藍耳病疫 苗的製備。
培養過程中的溫度、溶解氧濃度、攪拌轉速、pH值等原則上並不重要， 取決於所選用細胞的種類。優選地，溫度、溶解氧濃度、pH值被選擇為其 對細胞和病毒的生長和生產率來說是最優的。本領域技術人員知道如何找到這 些最優的條件。通常，最優溫度介於36.5 -37。C之間，最優溶解氧濃度介於 20% - 60%飽和空氣度，pH值介於6.8 - 7.2之間。
病毒滴度TCID5o的測定按照常規方法進行，比如可以按照文獻方法進行 (韓先傑，王宏偉，王金寶豬繁殖與呼吸症候群病毒TCID5o的測定萊陽農學 院學報22(2): 132— 134, 2005)。
實施例1、在50升生物反應器中孩i載體培養Marcl45細胞生產藍耳病疫
苗
微載體cytodex-l (GE生命科學，Cat No. 17-0485-03) 豬繁殖和呼吸綜合症病毒NVDC-JXA1抹。
培養基Marcl45細胞反應器高密度培養基(北京清大天一生物技術有限 公司，CatNo.MD900， Lot No. 080310 )
在50升生物反應器中，將cytodex-l用PBS衝洗、浸泡幾遍，高壓滅菌 後，往生物反應器中接種Marcl45細胞，細胞生長至2xl06cells/ml的細胞密 度後進行灌注培養，待活細胞密度達到6xl(^cells/ml後，更換病毒液，按病毒 感染複數MOI-0.015接種豬繁殖與呼吸症候群病毒。接著，通過灌注培養的 方式維持病毒繁殖所需要的營養條件和6.9-7.3的pH值，從第1-3天起收穫病 毒液，收穫的病毒液經-20。C凍融後，測定其TCID5。/ml。將所收穫的病毒液放 置於2-8。C中，並保存在-20。C，凍融l次，過濾、滅活、乳化後製備疫苗。
圖l表示細胞生長過程的細胞生長曲線。培養2-4天時間後，收穫階段收 集的病毒液的病毒滴度與轉瓶培養工藝相比，提高了 0.3-1個TCIDso/ml(即病毒滴度是轉瓶培養工藝的10^"倍)。
在以上教導的指導下，可以進行關於本發明的各種改進和變化。因此，可 以理解的是，在後附的權利要求的範圍內，可以以除了本文具體描述的方式之 外的其他方式實施本發明。
權利要求
1.一種培養敏感細胞生產藍耳病疫苗的方法，其包括以下步驟1)用微載體培養敏感細胞；2)在微載體培養的所述敏感細胞上接種豬繁殖與呼吸症候群病毒；3)繼續培養所述敏感細胞；4)收穫病毒液，生產藍耳病疫苗。
2. 根據權利要求1所述的方法，其特徵在於步驟1)用微載體培養敏 感細胞是按以下過程進4亍的將微載體經清洗和高溫滅菌之後，接種所述敏感 細胞，接著培養細胞到細胞密度為3 x 106-10 x 106 cells/ml。
3. 根據權利要求2所述的方法，其特徵在於所述培養細胞採用流加或 灌注i昏養方式。
4. 根據權利要求1-3中任何一項所述的方法，其特徵在於步驟2)中， 按病毒感染複數MOI為0.01 - 0.5的量接種所述豬繁殖與呼吸症候群病毒。
5. 根據權利要求4所述的方法，其特徵在於所述病毒感染複數MOI 為0.01-0.2。
6. 根據權利要求1 - 3中任何一項所述的方法，其特徵在於步驟3)中 所述繼續培養所述敏感細胞是採用流加培養或灌注培養方式，維持pH在6.9 - 7.3的範圍和病毒繁殖所需要的營養條件。
7. 根據權利要求4所述的方法，其特徵在於步驟3)中所述繼續培養 所述敏感細胞採用流加培養或灌注培養方式，維持pH在6.9-7.3的範圍和病 毒繁殖所需要的營養條件。
8. 根據權利要求1-3中任何一項所述的方法，其特徵在於所述敏感細 胞選自Marcl45細胞或MA104細胞。
9. 根據權利要求1 - 3中任何一項所述的方法，其特徵在於所述方法是 在生物反應器中進行的。
10. 根據權利要求9所述的方法，其特徵在於所述生物反應器包括攪拌 式生物反應器、氣升式生物反應器、wave生物反應器和中空纖維反應器。
全文摘要
本發明提供了一種培養敏感細胞生產藍耳病疫苗的方法，其包括以下步驟1)在生物反應器中用微載體培養敏感細胞；2)在微載體培養的所述敏感細胞上接種豬繁殖與呼吸症候群病毒；3)繼續培養所述敏感細胞；4)收穫病毒液，生產藍耳病疫苗。該方法應用微載體培養技術在生物反應器中培養敏感細胞來生產藍耳病疫苗。因為微載體提供了更大的表面積，細胞可以生長到更高的細胞密度，而生物反應器的自動控制培養環境參數，使得細胞生長和病毒繁殖處於較優的環境，提高了病毒滴度，疫苗質量也更加穩定。
文檔編號A61K39/12GK101612395SQ200810115478
公開日2009年12月30日 申請日期2008年6月24日 優先權日2008年6月24日
發明者劉俊生, 王建超, 陳文慶 申請人:北京天和瑞生物科技有限公司