一種檢測表皮生長因子的電化學免疫傳感器及其製備方法

2023-09-19 03:30:00 3

一種檢測表皮生長因子的電化學免疫傳感器及其製備方法
【專利摘要】本發明公開了一種檢測表皮生長因子的電化學免疫傳感器及其製備方法。該傳感器由下至上依次由玻碳電極、修飾層a、修飾層b和修飾層c組成；其中，修飾層a為由式Ia或式Ib所示聚多巴胺構成的膜：式Ia和式Ib中，n均為1000-15000；修飾層b由表皮生長因子和穀胱甘肽構成，且所述表皮生長因子和穀胱甘肽均粘附於所述修飾層a上；修飾層c由表皮生長因子抗體修飾的納米銀溶膠製得。本發明通過表皮生長因子與其抗體的特異免疫識別反應，可構築檢測表皮生長因子的電化學免疫傳感器。該傳感器靈敏度良好、線性範圍較寬，檢出限低達0.2nmol/L，並有望用於實際樣品中表皮生長因子的檢測。式Ia式Ib
【專利說明】-種檢測表皮生長因子的電化學免疫傳感器及其製備方法

【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種檢測表皮生長因子的電化學免疫傳感器及其製備方法。

【背景技術】
[0002] 表皮生長因子（EGF)是由Cohen(1962)首次在小鼠的頜下腺中發現的一種多 肽，由53個胺基酸殘基組成，分子量為6201Da[呂文成，郭洪波等.中華器官移植雜誌， 1998. 19(1) :7-8]。EGF能刺激外胚層和內胚層起源的各種細胞如角膜、上皮、乳腺、肝和腎 上腺髓質細胞等，使其增殖。其在創面癒合，創傷性骨折，肝損傷的修復和再生，神經幹細胞 增殖，皮膚細胞更新等方面均有作用。因此，需要建立一種靈敏度高，快速有效的檢測表皮 生長因子的方法。
[0003] 目前存在EGF的臨床檢測方法，有ESLIA檢測法[吳學詩，夏勇等.國外醫學臨床 生物化學與檢驗學分冊，2005. 26(12) :869-871]、放射免疫分析法[陸明，王玉圮.放射免 疫學雜誌，2011. 24(6) :628-629]、比色法等。但這些方法均存在不足。ESLIA檢測法雖具 有靈敏度高、特異性強等特點，但該方法抗幹擾性差、市場出售的ESLIA試劑盒質量參差不 齊；放射免疫測定法雖具有操作簡便、成本低等優點，但該法不能檢測低含量物質，放射性 汙染嚴重，被測物和標準物均不能全部參與反應，因此應用範圍不廣；比色法雖具有靈敏度 高、經濟等優點，但該法操作步驟冗長，且實驗中所用的有機溶劑對人體有害。


【發明內容】

[0004] 本發明的目的是提供一種電化學免疫傳感器及其製備方法。
[0005] 本發明提供的電化學免疫傳感器，由下至上依次由電極、修飾層a、修飾層b和修 飾層c組成；
[0006] 其中，所述電極為玻碳電極；
[0007] 所述修飾層a為由式la或式lb所示聚多巴胺構成的膜：
[0008]
[0009] 式 la

【權利要求】
1. 一種電化學傳感器，由下至上依次由電極、修飾層a、修飾層b和修飾層c組成； 其中，所述電極為玻碳電極； 所述修飾層a為由式Ia或式Ib所示聚多巴胺構成的膜：
式Ia 式Ib
所述式Ia和式Ib中，n均為1000-15000 ; 所述修飾層b由表皮生長因子和穀胱甘肽構成，且所述表皮生長因子和穀胱甘肽均粘 附於所述修飾層a上； 所述修飾層c由表皮生長因子抗體修飾的納米銀溶膠製得。
2. 根據權利要求1所述的傳感器，其特徵在於：所述表皮生長因子抗體修飾的納米銀 溶膠中，納米銀顆粒的粒徑為50-100nm。
3. 根據權利要求1或2所述的傳感器，其特徵在於：所述表皮生長因子抗體修飾的納 米銀溶膠為按照包括如下步驟的方法製備而得： 1) 將巰基乙酸和納米銀溶膠於PH值為中性的條件下反應10_30min，得到巰基乙酸修 飾的納米銀溶膠； 2) 於pH值為5-6的條件下，將步驟1)所得巰基乙酸修飾的納米銀溶膠、EDC的水溶液 和NHS的水溶液混合攪拌10-30min，得到活化的納米銀溶膠； 3) 將步驟2)所得活化的納米銀溶膠與表皮生長因子抗體於搖床中振蕩l-4h，調節體 系的pH值至中性，得到所述表皮生長因子抗體修飾的納米銀溶膠。
4. 根據權利要求3所述的方法，其特徵在於：所述步驟1)納米銀溶膠中，納米銀顆粒 的粒徑為20-50nm; 所述反應步驟中，時間為15min; 所述納米銀溶膠為按照包括如下步驟的方法製備而得：將NaBH4的水溶液與AgNO3的水 溶液於冰水浴中進行反應5-20min，反應完畢而得；所述反應步驟中，時間具體為IOmin; 所述NaBH4 的水溶液的濃度為IX10_3mol/L-5X10_3mol/L，具體為 2X10_3mol/L; 所述AgNO3 的水溶液的濃度為 0. 5X10_3mol/L-3X10_3mol/L，具體為IX10_3mol/L; 所述NaBH4的水溶液與AgNO3的水溶液的體積比具體為4 :1 ; 所述步驟2)中，EDC的水溶液和NHS的水溶液的濃度均為IX10_3mol/L-5X10_3mol/L，具體為2Xl(T3m〇l/L;EDC的水溶液和NHS的水溶液的體積比為1 :1 ;所述納米銀溶膠中 的納米銀顆粒、EDC和NHS的摩爾比為0. 5mmol:0. 5mmol; 所述步驟3)振蕩步驟中，時間為2小時。
5. -種製備權利要求1-4任一所述電化學傳感器的方法，包括如下步驟： 1) 將所述電極浸泡於多巴胺的tris緩衝溶液中浸泡30min後，用二次水洗滌並浸泡， 於空氣靜置晾乾8h後，在所述電極表面得到所述修飾層a; 2) 將步驟1)所得電極於EGF的水溶液中浸泡30min後，再於GSH的PBS緩衝液中浸泡 30min，即在所述修飾層a上得到所述修飾層b; 3) 將步驟2)所得電極浸泡於權利要求3所述表皮生長因子抗體修飾的納米銀溶膠中 孵育lh，得到所述電化學傳感器。
6. 根據權利要求5所述的方法，其特徵在於：所述步驟1)中，多巴胺的tris緩衝溶液 的pH值為8-9,具體為8. 5,濃度為0? 05-0. 2mg/ml，具體為0?lmg/ml; 所述步驟2)中，EGF的水溶液的濃度為10iiM;所述GSH的PBS緩衝液的pH值為7. 0， 濃度為20mg/ml;
7. 根據權利要求6所述的方法，其特徵在於：所述步驟1)中，所述納米銀溶膠中，納米 銀顆粒的粒徑為20-50nm; 所述步驟2)中，EDC的水溶液和NHS的水溶液的濃度均為2Xl(T3m〇l/L;所述納米銀 溶膠中的納米銀顆粒、EDC和NHS的摩爾比為0. 5mmol:0. 5mmol。
8. 權利要求1-4任一所述電化學傳感器在檢測EGF含量中的應用。
【文檔編號】G01N33/68GK104267190SQ201410446894
【公開日】2015年1月7日 申請日期:2014年9月3日 優先權日:2014年9月3日
【發明者】林雨青, 劉康玉, 黎琳波, 胡良璐, 李琳 申請人:首都師範大學