一種棉花抗黃萎病的苗期鑑定方法

2023-09-19 05:33:35

專利名稱：一種棉花抗黃萎病的苗期鑑定方法
技術領域：
本發明屬於棉花抗病育種技術領域，具體涉及一種棉花抗黃萎病的苗期鑑定方法，本發明涉及一種利用苗盤移苗蘸根法鑑定棉花苗期黃萎病的抗性，為作物抗病育種提供抗性材料的早期快速鑑定。
背景技術：
棉花黃萎病(Verticillium dahliae. Kleb.)是世界毀滅性土傳維管束病害,嚴重影響棉花的產量和品質，可侵染多種草本作物、木本作物、花卉及木本觀賞植物，如草莓、番茄、薄荷、橄欖樹、辣椒、油菜、茄子、土豆、向日葵、菊花、玫瑰、楓樹等。國內外學者普遍認為，選育和利用抗病品種是防治棉花黃萎病經濟而有效的途 徑。棉花抗黃萎病鑑定是抗病育種和抗病材料篩選必不可少的環節。因此篩選抗原材料，供育種工作者合理選擇親本，進而選擇抗性穩定的品種，供生產上應用顯得迫切需要。抗源的篩選，需要進行大規模的棉花種質資源的抗性評價為基礎，因而急需建立一種快速，簡便，致病力穩定，規範，實用的抗病性鑑定技術。目前棉花抗黃萎病鑑定主要是通過人工病圃鑑定和室內苗期鑑定。人工病圃鑑定被認為是最接近自然實際，最為可靠的抗病鑑定方法，在抗病育種過程中應用最為普遍。但此鑑定方法受鑑定病圃限制，歷時太長，易受氣候條件的影響，且具有較強的季節性。棉花苗期鑑定方法簡便、迅速、容易控制外界環境條件。常用的有四種，包括針刺法(顧本康，李經儀，棉花黃萎病菌實針接種試驗[J]，江蘇農業科學，1984，(I) :47.)、紙缽撕底法(石磊巖等，棉花黃萎病苗期鑑定方法，植物保護，1987，(I) :42.)、無底塑缽菌液澆根法(簡桂良，孫文姬，馬存，棉花黃萎病抗性鑑定新方法-無底塑缽菌液澆根法，棉花學報，2001，13 (2) 67-69)、六稜塑料缽定量注菌液法(馬峙英，王省芬，張桂寅，等.河北省棉花黃萎病菌致病性的研究，棉花學報，1997，(9) I :15-20.)。其中針刺法具有強迫接種的特點，不能準確的反應棉苗的抗性；紙缽撕底蘸根法是年代70年代至80年代經過多年試驗研究確定的溫室苗期鑑定方法，具有快速、準確、易操作等優點，但是製作紙缽費工費時，且在育苗時容易汙染。無底塑缽菌液澆根法和六稜塑料缽定量注菌液法的育苗時間長，傷根不均勻，鑑定時間長。四種鑑定方法均有一定的缺點，這是造成苗期鑑定結果與人工病圃鑑定存在顯著差異的原因之一。建立快速、準確的鑑定方法，以滿足當前棉花黃萎病基礎研究與抗病性鑑定的需要，顯得十分必要。

發明內容
本發明目的在提供一種鑑定結果穩定、可操作性強、鑑定方便、適合大批量材料進行快速的棉花黃萎病抗性鑑定的接種方法。本發明的技術方案如下一種棉花抗黃萎病的苗期鑑定方法，其特徵包括如下步驟I)浸種催芽，採用多孔聚乙烯泡沫育苗盤為載體，以泥炭、草炭和蛭石為培養基質，每個育苗盆配5L營養液；每5L水加250ml基礎營養液，再加25ml誘導液母液，在自然光照下進行棉花水浮育苗，培養時間為28-32d，備用；2)將冰箱中試管保存的保藏號為CCTCC NO M2011095的大麗輪枝菌6SY2-37轉移至盛有PDA培養基的培養皿中，之後將培養皿放在恆溫箱中進行活化，活化溫度為25°C，活化時間為10-15d，取一直徑約4mm的菌塊放入盛有50ml Czapek』 s培養基的三角瓶中，於25°C下振蕩培養5-6d;3)將步驟2)的病菌培養物用雙層紗布過濾，在顯微鏡下用血球計數板統計孢子數，用無菌水將孢子調至5X IO6個/ml的孢子懸浮液，待棉苗長到兩葉一心時連同基質一起從育苗盤中拔出，用乾淨的吸水紙將水生根上的水分吸乾，然後用剪刀剪去水生根根尖Icm進行傷根處理；將傷根後的水生根全部浸入保藏號為CCTCC NO :M2011095，濃度為5 X IO6個/ml的大麗輪枝菌孢子懸浮液中IOs後立即取出，不使基質散落，且基質不蘸菌；4)在塑料缽中事先鋪2. 5-3. 5cm厚的溼潤無菌土，將步驟3)蘸菌後的棉苗移栽於塑料缽中，一缽一苗，再用溼潤的無菌土覆蓋，覆蓋深度為離缽緣3-4cm處，之後再覆蓋幹 燥的無菌土以防其他雜菌的滋生，將塑料缽置於溫室中，培養溫度為25-28°C ;lh後澆少量的水，防止棉株萎焉，IOd後觀察黃萎病的發病情況；其中步驟I)所述的基礎營養液配方如下硝酸鉀38g/L，硝酸銨33g/L，七水硫酸鎂
7.4g/L，磷酸二氫鉀3. 4g/L，氯化鈣8. 8g/L ;補充蒸餾水至IL ；步驟I)所述的誘導液母液配方如下硼酸1.24g/L，硫酸錳4.46g/L，硫酸鋅I. 7g/L，鑰酸鈉0. 05g/L，硫酸銅0. 005g/L，氯化鈷0. 005g/L，硫酸亞鐵5. 56g/L，乙二胺四乙酸二鈉7. 46g/L ;補充蒸餾水至IL ；步驟2)所述的 Czapek』 s 培養基配方如下FeS040. 02g/L，NaN032g/L，MgS04lg/L，KCllg/L，KH2P04lg/L，蔗糖 30g/L ；pH6. 0 ;補充蒸餾水至 1L。申請人:從湖北省沙洋縣感染棉花黃萎病的棉株上分離得到一株專用於棉花抗黃萎病的苗期鑑定的菌株-大麗輪枝菌(Verticillium dahliae) 6SY2-37，於2011年3月25日送交湖北省武漢市武漢大學內的中國典型培養物保藏中心保藏，其保藏號為CCTCCN0 M2011095。本發明的優點和有益效果在於(I)接種後的棉苗發病迅速，發病顯著，可以有效區分不同棉花品種對病菌的抗感型，還能有效的區分不同致病生理型的菌株(2)通過棉苗逐個同一部位傷根、逐個蘸菌進行抗病鑑定，保證了傷根程度一致，接菌量一致，接種後發病均勻，結果穩定性好。其與普通裸根蘸菌法相比的優勢在於，普通裸根蘸菌法接菌時需洗去根部的土壤，由於根系在土壤中相互纏繞，盤根錯節，這樣在洗去根部土壤的同時就會不可避免地損傷根系，傷根程度很難做到統一。另外，普通裸根蘸菌法接菌移栽後的棉苗緩苗期大概需要一個星期的時間，而且子葉容易萎焉脫落，之後的病情調查容易產生誤差。苗盤移苗蘸根法的棉苗只是水生根蘸菌，移栽時攜帶有基質，基本上保持了根系的原貌，移栽成活率高，緩苗期短，最多不超過ld，很少出現子葉的萎焉，保證了病情調查的準確性。(3)本發明接種方法快速簡便、規範實用，可用於棉花品種抗病性鑑定和抗病材料的初步篩選、病原菌致病力測定、病原菌生理小種鑑別。更詳細的技術方案見《具體實施方式
》所述。


圖I.不同孢子液濃度條件下棉苗發病情況。該圖反映的是接菌濃度梯度試驗結果。由圖I可知，接菌濃度在5X IO5個/ml條件下，鄂棉24、DP410B和銀瑞361的病指都很低，達不到抗病鑑定要求。當接菌濃度為I X IO6個/ml時，鄂棉24和DP410B的病指沒有顯著差異，分別為30. 6和30. 2，銀瑞361的病指為14. 9。感病對照病指也較低，不能很好地反映各品種的真實抗性。當接菌濃度為5 X IO6個/ml時，鄂棉24的病指為50. 5，DP410B和銀瑞361的病指分別為49. 5和27. 5。鄂棉24和DP410B的病指亦無差異，DP410B 表現為感病，銀瑞361表現為耐病。當孢子液濃度為I X IO7個/ml和5X IO7個/ml時，鄂棉24和DP410B的病指相似，各品種的病指都很大，均表現為感病。可見，IX IO7個/ml和
5X IO7個/ml濃度下，菌液濃度過大，不宜用於抗病鑑定，因此，5 X IO6個/ml的大麗輪枝菌孢子液濃度較合適。圖2.不同傷根方法棉苗發病情況。由圖2可知，傷水生根Icm各品種的病指略低於傷水生根1/2各品種的病指，但差異不明顯，都能較好地區分出抗感品種，這表明傷水生根Icm和傷水生根1/2均可。筆者建議選用傷水生根lcm。切除所有的水生根時，各品種的病指都很大，均表現為感病，抗感品種區分不明顯。說明此種傷根過重，不宜用於抗病鑑定。圖3.各品種病指隨接菌後天數變化情況。該接種方法發病迅速，故把握適宜的病情調查時期至關重要。圖3反映的是在傷水生根1/2、孢子濃度5 X IO6個/ml條件下鄂棉24和銀瑞361的病指隨接菌後天數變化情況。一般接菌7d後，各品種子葉陸續顯現黃萎病症狀。感病對照鄂棉24的病指達到45-55的時期大約在接菌後的第13-16d。多次的重複試驗表明，適宜的病情調查時期為接菌後的第13-16d。過早病指偏低，超過此期限感病和抗病材料的病指均偏大，達不到鑑定效果。
具體實施例方式實施例I一、供試材料本發明所用的棉花品種有鄂棉24(湖北省農作物品種審定委員會審定的常規棉花品種，由湖北省黃網市農科院選育並提供種子，該品種已經公開推廣，參見網址http://baike. baidu. com/view/2089471, htm), DP410B(湖北省農作物品種審定委員會審定的常規抗蟲棉，由美國字棉公司選育，已在中國推廣，見網址http: //baike. baidu.com/view/4605450, html tp = 0 10)、銀瑞361 (抗蟲棉常規品種，山東省德州市銀瑞棉花研究所和中國農業科學院生物技術研究所聯合選育，在中國推廣應用，種子由中國農科院棉花研究所提供，見網址http://www. foodsl. com/content/409310/)。其中鄂棉24在生產上表現感病，DP410B、銀瑞361在生產上具有一定抗病性。所用的大麗輪枝菌是6SY2-37，由華中農業大學植物病理實驗室提供的強致病力的落葉型菌株。2007年10月從湖北省沙洋縣鄂雜棉10號中採集棉花黃萎病病株，採用升汞和酒精表面消毒法進行分離。將病株枝條洗淨、切段，在超淨工作檯中用無菌水清洗2-3次，再用70%的酒精消毒30s，無菌水清洗3-5次。然後用0. I %的升汞消毒2min，用無菌水清洗3-5次，用剪刀剪成小塊放入PDA培養基中，25°C恆溫培養3-4d，進行病原菌鑑定、菌種保存備用。採用稀釋平板法對篩選的菌株進行單孢分離。在培養15d的PDA平板上，用2_3mL的無菌水洗孢子，製成孢子懸浮液，經5層擦鏡紙過濾菌絲後，在顯微鏡下用血球記數板觀察，將菌液濃度稀釋為4X IO6個/ml，取0. Iml置入水瓊膠培養基平板上，均勻散開，培養皿底面劃成小方格，置24-25°C溫箱中12-24h後鏡檢，選取方格內只有單個孢子的做好標記，然後按無菌操作挑取方格內培養基，移入PDA平 板上，長出的菌落即為單孢菌系，移入試管斜面，保存備用。根據病原菌菌落的培養性狀，形態特徵，以及大麗輪枝菌分生孢子梗輪支狀；每輪有3 4分枝，含黑色的微菌核等特徵，對分離的菌株進行鑑定。菌種鑑定工作參照魏景超，《真菌鑑定手冊》，上海科學技術出版社，1979版介紹的方法。大麗輪枝菌6SY2-37的生物學特徵分生孢子長卵圓形，單細胞極少分隔，大小為2. 3 9. IX I. 5 3. Oum0分生孢子梗輪枝狀，每輪有3 4分枝，全長110 130um，分枝大小13. 8 21. 4 X 2. 3 2. 7um，梗基部無色透明，菌落生長無色菌絲體，生長較長時間菌絲變褐色，有隔膜直徑2 4um。菌絲體常呈膨脹狀，可由單根菌絲或數根菌絲芽殖形成菌核。不同地區棉花黃萎病菌微菌核形成的數量、大小和性狀有明顯的差異。將分離篩選的大麗輪枝菌6SY2-37於2011年3月25日送交湖北省武漢市武漢大學內的中國典型培養物保藏中心(CCTCC)保藏，其保藏號為CCTCC NO :M2011095。二、棉花水浮育苗棉花水浮育苗技術參照陳金湘等報導的方法(陳金湘等.棉花漂浮育苗技術[J].中國棉花，2006,33(11) =24-25.)採用多孔聚乙烯泡沫育苗盤為載體，以混配基質(泥炭、草炭和蛭石的混合物，按照重量比計為草炭泥炭蛭石=1:1: LpH 6-7)為支撐，每個育苗盆中加入以每5L水加250ml基礎營養液，再加25ml誘導液母液的比例配製的營養液水體5L作為苗床，進行漂浮育苗。使優良棉種出苗率達到90%以上，育成的棉苗根系發達，生活力強，生長整齊一致，少或無病，無雜草。育苗盤、基質購自荊州市利農水育苗器材有限公司。本發明將育苗盤從中間一分為二成兩個小的育苗盤(12個縱排,8個橫排)，橫排12個穴孔，縱排8個穴孔，共96個穴孔。育苗盆的長、寬、高分別為50cm、35cm、15cm。I、種子催芽選擇籽粒飽滿、成熟的前面所述的棉花種子，用濃硫酸脫絨。用50°C溫水浸種，並加入50%多菌靈可溼性粉劑(來源廠家山東省曲阜市爾福農藥廠)至濃度為5mg/ml，浸菌時間為10h，使種子充分吸水。種子充分吸水後，用清水衝洗種子，再浙幹多餘的水分，放在溼潤的雙層紗布上，然後再用溼潤的雙層紗布蓋住種子，最後放在恆溫箱裡，溫度設定30 0C，直至種子破胸或露出根尖。2、基質裝盤培養基質(來源廠家荊州市利農水育苗器材有限公司，成分為草炭泥炭蛭石=I : I : l,pH 6-7.)在實驗進行前用高壓鍋滅菌I小時(溫度121 °C，壓強0.6Mpa)。先將基質用水溼潤，使基質含水量達到自身重量的60%為宜(即手捏成團，手指間不見流水，下落後自然散開)。再將溼潤的基質裝入育苗盤的穴孔中，上下抖動育苗盤使穴孔中的基質壓實。穴孔中基質表面離盤面I. 0-1. 5cm。3、播種選擇破胸或根長相當於半粒種子長度的棉子播種，每穴孔播I粒，根尖朝下，播在穴孔的中間。播完後用基質進行覆蓋並壓實，基質與育苗孔表面相平。4、營養液的配製每盆配5L營養液。每5L水加250ml基礎營養液，再加25ml誘導液母液。基礎營養液配方硝酸鉀38g/L，硝酸銨33g/L，七水硫酸鎂7. 4g/L，磷酸二氫鉀3. 4g/L，氯化鈣8. 8g/L，補充蒸餾水至1L。誘導液母液配方如下硼酸I. 24g/L，硫酸錳4. 46g/L，硫酸鋅
I.7g/L，鑰酸鈉0. 05g/L，硫酸銅0. 005g/L，氯化鈷0. 005g/L，硫酸亞鐵5. 56g/L，乙二胺四乙酸二鈉7. 46g/L ;補充蒸餾水至1L。5、苗床管理待苗盤出苗整齊後放入育苗盆的營養液中，直至棉苗長至一葉一心或兩葉一心(依試驗而不同)。根據棉苗長勢酌情噴施縮節胺以防止高腳苗。三、棉苗培養採用水浮育苗技術進行棉苗的培養。所用的3個棉花品種各種2盤。四、病菌培養和孢子液的配製將棉花大麗輪枝菌6SY2-37在PDA培養基上活化，活化溫度25°C，黑暗生長7_10d後取直徑約4mm的菌塊放入盛有50ml Czapek’s培養基的三角瓶中，25°C下振蕩培養5_6d。然後，將病菌培養物用雙層紗布過濾。顯微鏡下用血球計數板統計孢子數，稀釋並配製成所需孢子濃度。所用 Czapek』 s 培養基配方為IL H20、0. 02g FeSO4,2g NaNO3Ug MgSO4UgKClUg KH2PO4、30g 蔗糖、pH = 6.0。五、接種方法待棉苗長到兩葉一心時連基質一起輕輕地從育苗盤中拔出，用乾淨的吸水紙將水生根上的水分吸乾，然後用剪刀水生根根尖Icm做傷根處理。之後將水生根全部浸入孢子懸浮液中(IOs)中立即取出(最好不讓基質散落，基質不蘸菌)，隨即將棉苗移栽在塑料缽中，一缽一苗。塑料缽中事先鋪3cm左右厚的溼潤無菌土，將蘸菌後的棉苗放入缽中後再用溼潤的無菌土覆蓋，覆蓋深度為離缽緣3-4cm處，之後再覆蓋乾燥的無菌土以防其他雜菌的滋生。放到溫室，溫度控制在25-28°C之間。I小時後澆少量的水，防止棉株萎焉。三個重複。IOd後觀察發病情況。六、發病情況調查與統計待感病品種普遍發病時，按表I標準記載各供試品種的發病等級。發病等級分為
0、1、2、3、4五個等級。然後根據發病等級計算病情指數，之後再根據所計算出的病情指數來判斷各品種對黃萎病的抗性。棉花抗黃萎病抗性分級標準見表2。表I棉苗病情分級標準
權利要求
1.一種棉花抗黃萎病的苗期鑑定方法，其特徵包括如下步驟 1)浸種催芽，採用多孔聚乙烯泡沫育苗盤為載體，以泥炭、草炭和蛭石為培養基質，每個育苗盆配5L營養液；每5L水加250ml基礎營養液，再加25ml誘導液母液，在自然光照下進行棉花水浮育苗，培養時間為28-32d，備用； 2)將冰箱中試管保存的保藏號為CCTCCNO :M2011095的大麗輪枝菌6SY2-37轉移至盛有PDA培養基的培養皿中，之後將培養皿放在恆溫箱中進行活化，活化溫度為25°C，活化時間為10-15d，取一直徑約4mm的菌塊放入盛有50ml Czapek』 s培養基的三角瓶中，於25°C下振蕩培養5-6d ； 3)將步驟2)的病菌培養物用雙層紗布過濾，在顯微鏡下用血球計數板統計孢子數，用無菌水將孢子調至5 X IO6個/ml的孢子懸浮液，待棉苗長到兩葉一心時連同基質一起從育苗盤中拔出，用乾淨的吸水紙將水生根上的水分吸乾，然後用剪刀剪去水生根根尖Icm進行傷根處理；將傷根後的水生根全部浸入保藏號為CCTCC NO :M2011095，濃度為5X IO6個/ml的大麗輪枝菌孢子懸浮液中IOs後立即取出，不使基質散落，且基質不蘸菌； 4)在塑料缽中事先鋪2.5-3. 5cm厚的溼潤無菌土，將步驟3)蘸菌後的棉苗移栽於塑料缽中，一缽一苗，再用溼潤的無菌土覆蓋，覆蓋深度為離缽緣3-4cm處，之後再覆蓋乾燥的無菌土以防其他雜菌的滋生，將塑料缽置於溫室中，培養溫度為25-28°C ;lh後澆少量的水，防止棉株萎焉，IOd後觀察黃萎病的發病情況； 其中 步驟I)所述的基礎營養液配方如下硝酸鉀38g/L，硝酸銨33g/L，七水硫酸鎂7. 4g/L，磷酸二氫鉀3. 4g/L，氯化鈣8. 8g/L ;補充蒸餾水至IL ； 步驟I)所述的誘導液母液配方如下硼酸I. 24g/L，硫酸錳4. 46g/L，硫酸鋅I. 7g/L，鑰酸鈉0. 05g/L，硫酸銅0. 005g/L,氯化鈷0. 005g/L，硫酸亞鐵5. 56g/L，乙二胺四乙酸二鈉7. 46g/L ;補充蒸懼水至IL ； 步驟 2)所述的 Czapek，s 培養基配方如下=FeSO4O. 02g/L, NaN032g/L, MgSO41g/L,KCllg/L，KH2P04lg/L，蔗糖 30g/L ；pH6. 0 ;補充蒸餾水至 1L。
2.一株專用於室內鑑定棉花苗期抗黃萎病的大麗輪枝菌6SY2-37，保藏在中國典型培養物保藏中心(CCTCC)，其保藏號為CCTCC NO :M2011095。
3.權利要求2所述的菌株在棉花黃萎病鑑定中的應用。
全文摘要
本發明屬於棉花抗病育種技術領域，具體涉及一種棉花抗黃萎病的苗期鑑定方法。主要的步驟為首先保藏於中國典型培養物保藏中心，保藏編號為CCTCC NOM2011095的棉花黃萎病菌6SY2-37在Czapek’s液體培養基中25℃搖培5d，紗布過濾，通過血球計數板計數，配成5×106個孢子/ml。待水培棉苗長到兩葉一心期時，連同基質拔苗，切去1cm水生根，蘸根10s接種，溼土埋入塑料缽中，接菌後立即澆水，防止棉苗萎焉，接種10天開始發病。本發明中接種後的棉苗存活率高，接菌均勻，發病迅速，操作方便，結果穩定性好。此外該方法耗時短，育苗時間短，管理方便，因此適合大批量的材料進行棉花抗黃萎病鑑定和病原菌致病力分化測定。
文檔編號C12Q1/18GK102732596SQ201110081889
公開日2012年10月17日 申請日期2011年4月1日 優先權日2011年4月1日
發明者史認輝, 徐飛, 惠慧, 郭小平 申請人:華中農業大學