對細胞進行原位標記的方法和應用的製作方法

2023-09-18 16:35:05 1

對細胞進行原位標記的方法和應用的製作方法
【專利摘要】本發明提供了一種對細胞進行原位標記的方法，包括如下步驟：（1）製備含有膽鹼類似物的細胞培養液；（2）對細胞進行原位標記。本發明提供的對細胞進行原位標記的方法先採用含有膽鹼類似物的細胞培養液培養細胞，然後用報告分子追蹤標記在細胞上的膽鹼類似物。本發明利用膽鹼類似物上標記的疊氮與報告分子上標記的二苯並環丁烯之間的特異性反應對細胞進行原位標記，該方法簡單易行，不僅能夠快速、高靈敏高解析度地對細胞膜、細胞器膜上的膽鹼類似物進行定位和示蹤，而且對細胞毒性低，且對細胞形態、細胞活性以及存活率影響小。此外，本發明提供了一種膽鹼類似物在製備細胞原位檢測試劑盒中的應用。
【專利說明】對細胞進行原位標記的方法和應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及生物【技術領域】，具體涉及對細胞進行原位標記的方法和應用。
【背景技術】
[0002]膽鹼(Cho)是細胞膜結構和脂蛋白構成上的重要組成部分。在真核生物中，磷脂頭端最普遍的基團是膽鹼，含磷脂膽鹼是細胞膜中最豐富的磷脂，也是細胞膜的主要結構成分，在細胞代謝和信號傳導中起著至關重要的作用Adrian Salic課題組利用膽鹼在細胞中的代謝途徑，通過對膽鹼的末端修飾炔基，並用帶疊氮的染料通過click銅催化對細胞內膽鹼的代謝行為進行示蹤分析。然而，在該方法採用的疊氮-炔基Husigen [3+3]環加成反應需要銅作為催化劑，催化劑銅的存在會引起細胞的毒性，因而在活細胞乃至活體的應用中受到很大的限制。
[0003]因此，有必要提供一種對細胞毒性低、影響小的細胞原位示蹤方法。

【發明內容】

[0004]為解決上述問題，本發明提供了一種對細胞進行原位標記的方法和應用。
[0005]本發明提供的對細胞進行原位標記的方法採用疊氮修飾的膽鹼與報告分子之間反應對細胞進行原位標記，該方法對細胞毒性低，且對細胞形態、細胞活性以及存活率影響小，能夠快速、高靈敏高解析度地對細胞膜上的膽鹼類似物進行定位和示蹤。
[0006]第一方面，本發明提供了一種對細胞進行原位標記的方法，其特徵在於，包括如下步驟:
[0007](I)製備含有膽鹼類似物的細胞培養液
[0008]提供不含血清的細胞培養液，加入膽鹼類似物至所述膽鹼類似物的終濃度為100μΜ~1000 μ Μ，其中，所述膽鹼類似物的結構式如Pl所示:
[0009]
【權利要求】
1.一種對細胞進行原位標記的方法，其特徵在於，包括如下步驟: (1)製備含有膽鹼類似物的細胞培養液 提供不含血清的細胞培養液，加入膽鹼類似物至所述膽鹼類似物的終濃度為100μΜ~1000 μ Μ，其中，所述膽鹼類似物的結構式如Pl所示:
2.如權利要求1所述的對細胞進行原位標記的方法，其特徵在於，所述待標記細胞為人類胚腎細胞、人乳腺癌細胞、人肺腺癌細胞或人卵巢癌細胞。
3.如權利要求1所述的對細胞進行原位標記的方法，其特徵在於，所述採用不含血清的細胞培養液重懸細胞至細胞終濃度為I X IO5~I X 107/ul。
4.如權利要求1所述的對細胞進行原位標記的方法，其特徵在於，所述報告分子與細胞進行孵育的條件為:加入報告分子至所述報告分子的終濃度為100μΜ~ΙΟΟΟμΜ，孵育的時間為10~40分鐘。
5.如權利要求1所述的對細胞進行原位標記的方法，其特徵在於，所述報告分子與細胞進行孵育後，採用PBS緩衝液洗滌細胞2~4次。
6.如權利要求1所述的對細胞進行原位標記的方法，其特徵在於，所述步驟(2)中，對所述染料分子為螢光素、羅丹明、菁染料分子、二苯乙烯、萘醯亞胺、香豆素類、吖啶類或芘類。
7.如權利要求6所述的對細胞進行原位標記的方法，其特徵在於，所述螢光素為異硫氰酸螢光素、羥基螢光素或四氯螢光素。
8.如權利要求6所述的對細胞進行原位標記的方法，其特徵在於，所述羅丹明為羅丹明101、四乙基羅丹明或羧基四甲基羅丹明。
9.如權利要求6所述的對細胞進行原位標記的方法，其特徵在於，所述菁染料分子為噻唑橙、噁唑橙、或多甲川系列菁染料。
10.如權利要求1所述的膽鹼類似物在製備細胞原位檢測試劑盒中的應用，其中，所述細胞為人類胚腎細胞、人乳腺癌細胞、人肺腺癌細胞或人卵巢癌細胞，所述膽鹼類似的結構式如Pl所示:
【文檔編號】G01N33/52GK103983764SQ201410154914
【公開日】2014年8月13日 申請日期:2014年4月17日 優先權日:2014年4月17日
【發明者】蔡林濤, 劉宏, 潘正銀, 張鵬飛, 李文軍, 潘宏, 馬軼凡 申請人:深圳先進技術研究院