用於診斷PAH基因突變的雜交膜條、PCR引物及試劑盒的製作方法
2023-09-15 19:34:55
本發明涉及分子生物學檢測，特別涉及一種用於診斷苯丙氨酸羥化酶(phenylalaninehydroxylase，PAH)基因突變的雜交膜條及用於擴增待檢樣品基因片段的聚合酶鏈式反應(PolymeraseChainReaction，縮略詞為PCR)引物和用於診斷PAH基因突變的試劑盒。
背景技術：
：苯丙酮尿症(phenylketonuria，PKU)是嚴重威脅人類健康的一種常染色體隱性遺傳性苯丙氨酸代謝異常病，絕大部分(98％-99％)是由苯丙氨酸羥化酶(phenylalaninehydroxylase，PAH)基因缺陷所致，使得PAH活性下降或缺乏，導致苯丙氨酸不能正常代謝，血液、組織中的丙氨酸及其旁路代謝產物堆積，最終導致中樞神經系統受到不可逆的損害，而出現精神行為異常、癲癇和智力低下等症狀。許多研究顯示PAH基因突變表現為高度遺傳異質性，在不同的民族和人種之間存在較大的差異。我國的平均發病率為1/11188。苯丙酮尿症可以通過飲食控制治療，一般需終身採用無(低)苯丙氨酸飲食療法，早發現早治療是其治療的關鍵，但是昂貴的治療費用給家庭和社會帶來了沉重的經濟負擔，而且不能從根本上降低PKU患兒的出生率。因此在出生前對胎兒進行診斷，預防患兒出生，能夠減少社會和家庭的負擔，提高人口素質，具有較高的臨床應用價值。造成苯丙酮尿症的原因一般為遺傳因素。苯丙酮尿症絕大部分由PAH基因突變引起，國際上報導的PAH基因突變有500多種，但其中有61.5％是錯義突變，13.5％是缺失突變，11.5％是剪切突變，其它還有插入、沉默等多種突變形式。不同種族和地區人群之間PAH基因突變位點及分布具有較大差異。如歐洲最常見的是R408W，IVS10-11G->A，IVS12+1G->A。俄羅斯遠東地區PKU患者，發現R408W佔63％。通過對古巴的28例PKU病人的檢測，發現古巴PKU患者的突變熱點為E208K(19.3％)和R261Q(15.8％)。對義大利PKU患者的分析，發現IVS10n-t11G>A(19.4％)和R261Q(13.5％)是義大利PKU患者的突變熱點。國際PAH基因研究協作組報導東方黃種人(日本、韓國、中國)的高頻突變位點是位於第12外顯子的R413P(25％)和位於第7外顯子的R243Q(18％)。這為我們大規模有針對性的開展PAH基因突變篩查及診斷提供了理論依據。目前，傳統基因診斷方法包括酶切，限制性片段長度多態性分析(restrictionfragmentlengthpolymorphism，RFLP)，直接測序等，這些方法或者不能定性，或者耗時費力、所需設備和耗材昂貴，更重要的是這些方法難以同時對多個基因突變位點進行檢測。而基因晶片法雖然能同時對不同基因位點進行檢測，但它所需設備和耗材昂貴，不適用於在臨床大規模推廣，應用受到限制。技術實現要素：本發明所要解決的技術問題是：彌補上述現有技術的不足，提出一種用於診斷PAH基因突變的雜交膜條、一種用於擴增待檢樣品基因片段的PCR引物，以及一種用於診斷PAH基因突變的試劑盒。本發明採用以下技術方案：一種用於診斷PAH基因突變的雜交膜條，包括基底，以及固定在所述基底上的突變檢測探針，每一條所述突變檢測探針分別對應包含一個PAH基因突變位點，所述PAH基因突變位點包括以下位點：R111X、R176X、EX6-96A>G、R241C、R243Q、R252Q、Y356X、V399V和R413P；每一條所述突變檢測探針包含15-25個鹼基的序列，在所述序列的中部位置包含其相對應的PAH基因突變位點的突變鹼基；所述突變檢測探針為SEQIDNO.1～SEQIDNO.9所示的序列或其反向互補序列的DNA。優選的，還包括分別與每一條所述突變檢測探針對應的正常對照探針，所述正常對照探針固定在所述基底上的與所述突變檢測探針不同的位置上。優選的，所述正常對照探針為SEQIDNO.10～SEQIDNO.18所示的序列或其反向互補序列的DNA。優選的，所述突變檢測探針的3』或5』端帶有氨基標記。優選的，所述正常對照探針的3』或5』端帶有氨基標記。一種用於擴增待檢樣品基因片段的PCR引物，所述PCR引物的擴增產物含所述的PAH基因突變位點，所述PCR引物為以下5對：SEQIDNO.19和SEQIDNO.20；SEQIDNO.21和SEQIDNO.22；SEQIDNO.23和SEQIDNO.24；SEQIDNO.25和SEQIDNO.26；SEQIDNO.27和SEQIDNO.28；其中SEQIDNO.19、SEQIDNO.21、SEQIDNO.23、SEQIDNO.25、SEQIDNO.27是上遊引物；SEQIDNO.20、SEQIDNO.22、SEQIDNO.24、SEQIDNO.26、SEQIDNO.28是下遊引物。優選地，所述擴增產物分別包括如下位點：引物SEQIDNO.19和SEQIDNO.20的擴增產物包含R111X位點，引物SEQIDNO.21和SEQIDNO.22的擴增產物包含R176X、EX6-96A>G位點，引物SEQIDNO.23和SEQIDNO.24的擴增產物包含R241C、R243Q、R252Q位點，引物SEQIDNO.25和SEQIDNO.26的擴增產物包含Y356X、V399V位點，引物SEQIDNO.27和SEQIDNO.28的擴增產物包含R413P位點。優選地，所述上遊引物和/或下遊引物的5』端帶有生物素或螢光標記。一種用於診斷PAH基因突變的試劑盒，其包含所述的用於診斷PAH基因突變的雜交膜條，以及含有所述的用於擴增待檢樣品基因片段的PCR引物的PCR反應液。本發明與現有技術對比的有益效果是：本發明是基於PCR-膜條雜交技術的基因檢測方法，能同時對多個不同基因突變位點進行檢測，由於固定在基底上的突變檢測探針的大致中間位置包含有PAH基因的基因突變位點，通過PCR-膜條雜交技術能直接對待檢者的基因型進行確診，對正常、突變雜合子、突變純合子等很容易判斷，具有高通量、高效率、價格低廉、使用方便等優點，有利於實現臨床快速檢測和大規模人群篩查。附圖說明圖1是本發明實施例的未檢出PAH基因突變樣品結果示例；圖2是本發明實施例的PAH基因突變雜合子樣品結果示例；圖3是本發明實施例的PAH基因突變純合子樣品結果示例；圖4是本發明實施例的PAH基因突變雙重雜合子樣品結果示例。具體實施方式下面對照附圖和結合優選具體實施方式對本發明進行詳細的闡述。1、雜交膜條的製備1.1、9條突變檢測探針和9條正常對照探針的製備按照表1和表2中的序列合成18條探針，突變檢測探針和/或正常對照探針的3』或5』端帶氨基標記，合成的方法為現有的常規的DNA合成法。表1：表2：註：表1和表2中的「M」代表突變檢測探針，「N」代表正常對照探針。突變檢測探針SEQIDNO.1～SEQIDNO.9分別對應包含一個如下所示的PAH基因突變位點：R111X、R176X、EX6-96A>G、R241C、R243Q、R252Q、Y356X、V399V、R413P，每一條突變檢測探針包含15-25個鹼基的序列，在序列的中部位置包含其相對應的苯丙氨酸羥化酶基因的突變鹼基。每一個正常對照探針都對應一條突變檢測探針，其和突變檢測探針固定在基底的不同位置上，SEQIDNO.10對應的基因突變位點為R111X，SEQIDNO.11對應的基因突變位點為R176X，SEQIDNO.12對應的基因突變位點為EX6-96A>G，SEQIDNO.13對應的基因突變位點為R241C，SEQIDNO.14對應的基因突變位點為R243Q，SEQIDNO.15對應的基因突變位點為R252Q，SEQIDNO.16對應的基因突變位點為Y356X，SEQIDNO.17對應的基因突變位點為V399V，SEQIDNO.18對應的基因突變位點為R413P。1.2、雜交膜條的製備a.用印表機在基底(本實施例中為尼龍膜)上列印位點陣列，並標明相應位點的探針名稱，正常對照探針與突變檢測探針固定在基底的不同位置上；b.用5％的EDAC溶液泡膜30分鐘，以活化尼龍膜表面的羧基；c.分別用探針稀釋液(10mmol/LTris，pH8.0)將18條探針稀釋至5μmol/L；d.按尼龍膜條上列印的位點陣列，將18條探針按探針名稱對應分別點加在尼龍膜相應位點上，探針上的氨基與尼龍膜表面的羧基發生交聯反應；e.待尼龍膜條乾燥後，用0.1mol/L的NaOH泡膜5分鐘，以封閉尼龍膜表面未反應的羧基；f.用純水洗滌尼龍膜，乾燥後備用。表3：本例中尼龍膜條上的探針陣列如下：111N111M241N241M356N356M176N176M243N243M399N399MEX6-96NEX6-96M252N252M413N413M註：「M」代表突變檢測探針，「N」代表正常對照探針。2、PCR引物擴增根據本項目待檢的9個突變位點的位置關係，設計了5對引物分別進行擴增，如表4所示，其中SEQIDNO.19、SEQIDNO.21、SEQIDNO.23、SEQIDNO.25、SEQIDNO.27是上遊引物，分別簡寫為PKU1F、PKU2F、PKU3F、PKU4F、PKU5F；SEQIDNO.20、SEQIDNO.22、SEQIDNO.24、SEQIDNO.26、SEQIDNO.28是下遊引物，分別簡寫為PKU1R、PKU2R、PKU3R、PKU4R、PKU5R；該表中，引物PKU1F和PKU1R擴增PAH基因的R111X位點，引物PKU2F和PKU2R擴增PAH基因的R176X、EX6-96A>G位點，引物PKU3F和PKU3R擴增PAH基因的R241C、R243Q、R252Q位點，引物PKU4F和PKU4R擴增PAH基因的Y356X、V399V位點，引物PKU5F和PKU5R擴增PAH基因的R413P位點，如表4所示：表4：上遊引物下遊引物擴增基因包含的檢測位點的突變類型PKU1FPKU1RPAHR111XPKU2FPKU2RPAHR176X、EX6-96A>GPKU3FPKU3RPAHR241C、R243Q、R252QPKU4FPKU4RPAHY356X、V399VPKU5FPKU5RPAHR413P上遊引物和/或下遊引物的5』端帶有生物素或螢光素(如Cy3、Cy5等)標記。本發明實施例為對下遊引物(PKU1R、PKU2R、PKU3R、PKU4R、PKU5R)進行生物素標記，其PCR擴增後的產物可與本發明實施例中的探針雜交，PCR引物的DNA序列如表5所示。表5：2.1、提取模板DNA：使用其它商業化試劑盒從待檢者的血液中提取模板DNA。2.2、合成10條引物：合成的方法為現有的常規的DNA合成法。2.3、配製PCR反應液：配製成25μL/人份的PCR反應液，每人份的PCR反應液中各成份及濃度分別為：10條引物濃度分別為0.2μmol/L、Taq酶為0.1U/μL、1×PCRBuffer、MgCl2為1.5mmol/L、dNTP為0.2mmol/L、模板DNA1～10ng/μL。2.4、PCR擴增：PCR擴增的反應程序為：95℃預變性5分鐘；95℃變性30秒，55℃復性30秒，72℃延伸45秒，循環35次；72℃再延伸5分鐘。PCR擴增後的產物包含待測病人的DNA片段。3、雜交及顯色3.1.雜交將PCR擴增後的產物與步驟1.2中的尼龍膜條加入到12mL的雜交液(2×SSC、0.1％SDS，pH7.4)中，在雜交箱中44℃雜交2～4小時以上。3.2.洗膜將尼龍膜條轉移到預熱至44℃的洗液(0.5×SSC、0.1％SDS，pH7.4)中，於44℃洗滌15分鐘。3.3.過氧化物酶(Peroxidase，縮略詞為POD)孵育將膜條放入新鮮配製的0.25U/mL的鏈黴親合素-POD(streptin-POD)溶液中，37℃孵育15分鐘，使鏈黴親合素與PCR產物中的生物素結合，POD連接到PCR產物上，洗去多餘的streptin-POD。3.4.顯色現配顯色液(0.1mol/L檸檬酸鈉、0.1mg/mLTMB、0.0015％H2O2)，將膜條放入顯色液中避光顯色10分鐘，有雜交產物的膜條上相應探針位置處會顯藍色斑點。4、結果判斷如圖1-4所示，膜條的顯色結果，通過肉眼判斷，以各位點顯色信號的有無來判斷待檢樣品是否存在基因突變，以及若有基因突變，是突變純合子還是雜合子。在第一個示例中，如圖1所示，若尼龍膜條上所有正常對照探針對應的位置都顯色，所有突變檢測探針對應的位置都不顯色，則可判斷為該檢測樣品未檢出突變，基因型可以簡寫為N/N。在第二個示例中，如圖2所示，若有一個突變檢測探針對應的位置顯色，且所有的正常對照探針對應的位置都顯色，則該樣品可判斷為突變雜合子，基因型可以簡寫為M/N，並在M前加上發生突變的位點，本例中，基因型為252M/N。在第三個示例中，如圖3所示，若有一個突變檢測探針對應的位置顯色，且其相對應的正常對照探針對應的位置不顯色，其餘的正常對照探針對應的位置均顯色，則該樣品可判斷為突變純合子，基因型可以簡寫為M/M，並在兩個M前都加上發生突變的位點，本例中，基因型為356M/356M。在第四個示例中，如圖4所示，若有兩個突變檢測探針對應的位置顯色，且所有的正常對照探針對應的位置都顯色，則該樣品可判斷為雙重突變雜合子，基因型也可以簡寫為M/M，並在兩個M前分別加上兩個突變位點(不分先後)，本例中，基因型為413M/356M。本發明實施例中的以上所述4種情況為絕大多數病例可能出現的情況，若結果超出上述4種情況，在確認實驗操作無誤的情況下，應每個病例具體分析結果。針對中國人中最常見的9種PAH基因突變類型，通過將含有9種PAH基因突變位點的突變檢測探針固定在膜條上，與待檢者相應DNA片段的PCR產物雜交，可同時檢測PAH基因突變的這9種突變類型：R111X、R176X、EX6-96A>G、R241C、R243Q、R252Q、Y356X、V399V、R413P。本發明是基於PCR-膜條雜交技術的基因檢測方法，能直接對待檢者的基因型進行確診，具有準確性高、特異性強，能檢出基因隱性攜帶者等優點。因此，可以在婚檢或孕檢中使用該方法對準父母進行基因檢測，然後根據情況，必要時對胎兒進行產前檢測，這樣就可以大大減少苯丙酮尿症患兒的出生。本發明是基於PCR-反向點雜交技術的基因檢測方法，能直接對待檢者的基因型進行確診，具有準確性高、特異性強，能檢出基因隱性攜帶者等優點。用本方法進行檢測不需要貴重的專用儀器，只需要PCR實驗室常規的設備即可，適用於在國內醫院大範圍推廣使用。以上內容是結合具體的優選實施方式對本發明所作的進一步詳細說明，不能認定本發明的具體實施只局限於這些說明。對於本發明所屬
技術領域：
的普通技術人員來說，在不脫離本發明構思的前提下，做出若干等同替代或明顯變型，而且性能或用途相同，都應當視為屬於本發明的保護範圍。序列表深圳市億立方生物技術有限公司用於診斷PAH基因突變的雜交膜條、PCR引物及試劑盒17A100034JYC28120DNA人工序列1gagctttcatgagataagaa20216DNA人工序列2gcccatcccttgagtg16318DNA人工序列3attgtactcacagcaagc18416DNA人工序列4ggtttctgcctccgac16516DNA人工序列5acaggttggaggcgga16620DNA人工序列6aagaaatcctgagaggaaag20720DNA人工序列7gcctacagtaatgcttatca20820DNA人工序列8tcacctaactttctccttgg20918DNA人工序列9cttctcagttccctacga181020DNA人工序列10gagctttcacgagataagaa201116DNA人工序列11catccctcgagtggaa161218DNA人工序列12tgtactcatagcaagcat181315DNA人工序列13tggtttccgcctccg151415DNA人工序列14cacaggtcggaggcg151518DNA人工序列15gaaatcccgagaggaaag181619DNA人工序列16ggcctacagtactgcttat191720DNA人工序列17ctcaccttactttctccttg201818DNA人工序列18ttctcagttcgctacgac181917DNA人工序列19gctagcctgcctgctct172021DNA人工序列20gaagacagtgtggagttactt212118DNA人工序列21acccctgcttgagacacc182219DNA人工序列22catggaagccacagtactt192319DNA人工序列23gatgcgtcaaagcctatgt192419DNA人工序列24atgaacccaaacctcattc192517DNA人工序列25atagggatgcagcaggg172619DNA人工序列26accacccacagatgagtgg192719DNA人工序列27cggcttcactcaagcctgt192820DNA人工序列28gatggtagggaaagacagtc20當前第1頁1 2 3