β-1,4-內切木聚糖酶(AorXyn11A)基因的克隆及重組酶的製備的製作方法

2023-09-16 08:13:00 2

專利名稱：β-1,4-內切木聚糖酶(Aor Xyn11A)基因的克隆及重組酶的製備的製作方法
技術領域：
本發明涉及源自米麴黴(Aspergillus oryzae)CICC 40186菌株的一種糖苷水解酶11家族的木聚糖酶基因序列的克隆，木聚糖酶工程菌的構建以及重組木聚糖酶的高效表達和純化的方法，屬於生物工程技術領域。
背景技術：
纖維素、半纖維素和木質素是植物細胞壁的主要成分，而木聚糖是植物半纖維素的重要組成部分，它是繼纖維素之後含量第二豐富的可再生生物資源。木聚糖酶是降解木聚糖的一組酶的總稱，由於木聚糖的來源不同，其結構的複雜性也不同，它的完全降解需要多種水解酶的參與共同作用完成，如內切木聚糖酶、β-D-木糖苷酶、葡糖糖醛酸酶以及α-L-阿拉伯呋喃糖酶等。其中最重要的是β-1，4_內切木聚糖酶(endo-β-Ι， 4-xylanase, EC 3. 2. 1. 8)，它能從木聚糖主鏈的內部隨機切割木糖苷鍵，將其降解成寡聚木糖、木二糖和少量木糖，是半纖維素類資源轉化和利用不可缺少的生物催化劑。大多數微生物木聚糖酶都是單亞基蛋白，不同微生物來源的木聚糖酶等電點各不相同，大多數β -ι， 4-內切型木聚糖酶的最適ρΗ值為4. O 7. 0，ρΗ穩定範圍為3. O 10. O ；最適反應溫度在 40°C 75°C之間。通常真菌木聚糖酶比細菌木聚糖酶的溫度穩定性差，而且真菌木聚糖酶的最適PH值更偏酸性。木聚糖酶在各方面的應用很廣泛，比如在飼料工業、造紙工業、生物能源、食品與醫藥工業等方面。現在國內外對木聚糖酶的研究主要集中在兩個方面，一方面是研究如何提高木聚糖酶的表達水平，以期在工業生產中推廣應用。另一方面是對木聚糖酶進行基因改造，改善其酶學性質，使之更適合工業應用要求。但就國內外相關文獻或專利報導來看， 微生物木聚糖酶發酵酶活性普遍不高，導致了生產成本很高，從而阻礙了該酶在眾多領域中的廣泛應用。為了提高木聚糖酶的發酵產率和酶活性，早期的研究工作主要集中在產酶菌種的篩選、誘變、產酶誘導，酶的分離純化及性質，酶水解底物方式及應用等方面。進入 90年代，隨著基因工程技術和蛋白質工程技術的廣泛應用，研究工作逐步轉向酶基因的克隆和表達以及酶活性位點的研究等方面。目前，雖已有一些有關木聚糖酶基因的克隆和表達的文獻和專利報導，但有關來源於米麴黴木聚糖酶基因的克隆和表達等的研究未見有報導。

發明內容
本發明的目的是提供一種米麴黴(Aspergillus oryzae)CICC 40186菌株新型木聚糖酶基因序列克隆，木聚糖酶工程菌的構建以及重組木聚糖酶的高效表達和純化的方法。生物信息學分析表明，來源於A.0ryZae CICC 40186菌株的一種新型殼聚糖酶屬於糖苷水解酶第11家族，命名為Aor XynllA，其相應的基因命名為iVorxynllA。Aor XynllA具有較高的催化活性和熱穩定性，有較大的工業化生產和應用潛力及經濟價值。
本發明的技術方案一種源自A.oryzae CICC 40186菌株新型iVor XynllA基因的核苷酸序列分別為SEQ ID NO=I0A. oryzae菌株從中國工業微生物菌種保藏管理中心(CICC)購買。所述的由完整mRNA序列推導的iVor XynllA胺基酸序列為SEQ ID NO :2。所述的重組iVor XynllA的活性測定方法於25mL具塞試管A和B中，各加入用pH 4. 6、檸檬酸-磷酸二氫鈉緩衝液配製的質量濃度為0.5%的樺木木聚糖溶液2. 4mL，50°C預熱lOmin，在A管中加入0. ImL適當稀釋的酶液，50°C準確反應20min ；立即各加入2. 5mL 3'，5' - 二硝基水楊酸(DNS)試劑，在B 管中再補加0. ImL酶液，A和B管均煮沸7min ；冷卻後各加去離子水5mL，搖勻；540nm處以 B管為空白對照測定A管吸光度值，並從木糖標準曲線上查出相應的還原糖(以木糖計)含量並折算成酶活性單位。酶活性單位定義在本測定條件下，以每分鐘產生1 μ mol還原糖所需的酶量定義為1個殼聚糖酶活性單位(U)。所述的^VorxynllA完整mRNA序列的克隆和表達方法(I)Aor xynllA 3'端 mRNA 序列的克隆首先對 Aspergillus terreus (GenBank XP_001216082. 1) 、Aspergillus clavatus(GenBank XP_001273773. 1) 、Aspergillus fumigatus(GenBank XP_748354. 1)和 Aspergillus niger(GenBank AAM08362. 1)GH11 的木聚糖酶序列進行同源比對，找出兩段7個胺基酸的保守序列；再對該兩段胺基酸序列的 mRNA進行同源比對，設計兩條正向簡併引物XynFl和XynF2。XynFl :5，-TACTA(C/T)TCCTTCTGGAC(C/T)GA-3，XynF2 5，-GGCAACTTTGTCGG(C/T)GG(G/A)A-3，提取A.oryzae CICC 40186 的總 RNA，按照 TaKaRa RNA PCR Kit(Ver. 3. 0)說明書進行RT-PCR擴增。將兩輪PCR擴增產物用瓊脂糖凝膠電泳分析，割膠回收目的條帶並與pUCm-T載體連接(pUCm-T-XynllA3')，轉化JM109，經酶切鑑定正確後送上海生工測序，得到Aor xynllA 3'端mRNA序列。(2)Aor xynllA 5'端mRNA序列的克隆基於上述得到的iVor xynllA 3'端mRNA 序列，設計兩條反向引物XynRl和XynR2。XynRl TCCGGAGTAGGTGATTGCTCTXynR2 CCATCCTTTCCCGCCGACGA按照TaKaRa 5' -Full RACE Kit說明書進行5' -RACE。將兩輪PCR產物用1 %瓊脂糖凝膠電泳分析，割膠回收目的條帶並與PUCm-T連接(pUCm-T-XynllA5')，轉化JM109， 經酶切鑑定正確後送上海生工測序，得到Aor xynllA 5'端mRNA序列。(3) Aor xynllA的生物信息學分析將Aor xynllA的5『和3『端mRNA序列進行拼接，得到自轉錄起始位點至Poly(A)完整的mRNA序列；在NCBI上對開放閱讀框架(Open Reading Frame)進行分析，進而推導出Aor XynllA的胺基酸序列；進行信號肽預測。(4)含編碼iVor XynllA成熟肽基因的表達質粒的構建基於上述得到的^Vor xynllA完整mRNA序列以及預測的信號肽序列，設計一條正向引物XynF3和一條反向引物 XynR30XynF3 5' ~GAATTCTCCACACCCAGTAGCAC~3 『，含 EcoR I 酶切位點XynR3 5' ~GCGGCCGCTCAATAAACAGTGATAGCAG~3 『，含 Not I 酶切位點
按照TaKaRa RNA PCR Kit(Ver. 3. 0)使用說明書進行 RT-PCR。以 Oligo dT-Adaptor Primer為引物進行反轉錄合成cDNA的第一條鏈；以M13 Primer M4和XynF3 為引物進行第一輪PCR;以XynF3和XynR3為引物進行第二輪PCR。將兩輪PCR產物用
瓊脂糖凝膠電泳分析，割膠回收目的條帶並與PUCm-T連接(pUCm-T-xynllA)，轉化JM109， 經酶切鑑定正確後送上海生工測序。將測序結果正確的pUCm-T-xynA與pPIC9K質粒均用EcoR I和Not I進行雙酶切，割膠回收的酶切產物在T4 DNA連接酶的作用下進行連接，得到重組質粒 pPIC9K-xynllA(圖2)，並對重組質粒進行序列測定。(8)GS115/xynllA的構建、表達、產物純化及活性測定用Ml I對pPIC9K_xynllA 進行線性化，按照畢赤酵母表達手冊進行電轉、篩選，得到高拷貝的畢赤酵母重組子GS115/ xynllA ；按照手冊上的標準流程進行誘導表達，用DNS法測定木聚糖酶活性；發酵液經冷凍離心、超濾、離子交換層析和凝膠過濾層析，得到電泳純的重組木聚糖酶。本發明的有益效果本發明提供了一種A.oryzae CICC 40186菌株新型木聚糖酶基因序列克隆，木聚糖酶工程菌的構建以及重組木聚糖酶的高效表達和純化的方法，並對序列進行生物信息學分析。生物信息學分析表明來源於A.0ryZae CICC 40186的一種新型木聚糖酶屬於糖苷水解酶的第11家族，命名為Aor XynllA，其相應的基因命名為 AorxynllA0 Aor XynllA具有較高的催化活性和熱穩定性，有較大的工業化生產、應用潛力和經濟價值。


圖1 重組質粒pPIC9K_xynllA的構建示意圖
具體實施例方式以下結合具體實施例，進一步闡述本發明的操作方法。但是這些實施例僅用於詳細說明本發明，而不用於限制本發明的範圍。實施例1 Aor xynllA 3'端mRNA序列的克隆以Oligo dT-Adaptor Primer為引物反轉錄合成cDNA的第一條鏈；以M13 Primer M4和XynFl為引物進行第一輪PCR，其反應條件為94°C 2min，30個循環(94 °C 30s, 53 °C 30s, 72 °C 90s) ,72 °C IOmin;以 M13 Primer M4 和 XynF2 為引物進行第二輪 PCR，其反應條件為94°C 2min，30 個循環(94°C 30s, 52°C 30s, 72°C 90s)，72°C IOmin0 將兩輪 PCR 產物用瓊脂糖凝膠電泳分析，回收目的條帶並與PUCm-T連接(pUCm-T-XynllA3')，轉化 JM109,經酶切鑑定正確後送上海生工測序。實施例2 Aor xynllA 5'端mRNA序列的克隆以 5' -Full RACE Kit 的 Outer Primer 和 XynRl 為引物進行第一輪 PCR，其反應條件為94°C 3min, 30 個循環(94°C 30s, 55°C 30s, 72°C 60s)，72°C IOmin ；以 hner Primer 和XynR2為引物進行第二輪PCR，其反應條件為94°C 3min，30個循環(94°C 30s, 55°C 30s, 72 °C 60s), 72 °C IOmin0將兩輪PCR產物用1 %瓊脂糖凝膠電泳分析，回收目的條帶並與 pUCm-T連接(pUCm-T-xynllA 5')，轉化JM109，經酶切鑑定正確後送上海生工測序。實施例3含編碼iVor XynllA成熟肽基因的表達質粒的構建
以Oligo dT-Adaptor Primer為引物進行反轉錄合成cDNA的第一條鏈；以XynF3 和M13 Primer M4為引物進行第一輪PCR，反應條件為94°C anin，30個循環(94°C 30s， 53 °C 30s, 72 °C 60s), 72 °C IOmin ；以 XynF3 和 XynR3 為引物進行第二輪 PCR，反應條件為 94 0C 2min，30 個循環(94 °C 30s, 53 °C 30s, 72 °C 45s), 72 °C IOmin0 將第二輪 PCR 產物用 1 %瓊脂糖凝膠電泳分析，回收目的條帶並與PUCm-T連接(pUCm-T-xynllA)，轉化JM109，經酶切鑑定正確後送上海生工測序。將測序結果正確的pUCm-T-xynllA與pPIC9K質粒均用 EcoR I和Not I進行雙酶切，回收的酶切產物在T4 DNA連接酶的作用下進行連接，得到重組質粒pPIC9K-XynllA，並對重組質粒進行序列測定。實施例4 GS115/xynllA的構建、表達、產物純化及活性測定用Ml I對pPIC9K-xynllA進行線性化，按照畢赤酵母表達手冊進行電轉化、 篩選，得到高拷貝的畢赤酵母重組子GS115/xynllA。該基因工程菌用1.0%甲醇誘導表達96h，採用DNS法測得發酵液中重組殼聚糖酶活性達155U/mL。發酵液經離心後的上清液為重組Aor XynllA粗酶液，該粗酶液經截留分子量為IOkDa的超濾膜濃縮，再經 DEAE-Sepharose Fast Flow離子交換層析和kphadex G_75凝膠過濾層析純化，純化後經 SDS-PAGE檢測為單一條帶，並顯示重組iVor XynllA的分子量為23kDa。該重組iVor XynllA 的最適作用溫度50°C，最適作用pH 5. 5，該酶在pH 4. 5-7. 5、40°C以下穩定。
權利要求
1.一種來源於米麴黴(Aspergillus oryzae)CICC 40186菌株糖苷水解酶第11家族 (GHll)的新型木聚糖酶基因(Aor xynllA)，其核苷酸序列為SEQ ID NO=I0
2.由權利要求1所述的殼聚糖酶基因(AorxynllA)編碼的新型殼聚糖酶(Aor XynllA)，其完整的胺基酸序列對應於序列表中的為SEQ ID NO :2。
3.Aor xynllA基因序列的獲取方法(1)AorxynllA 3' ^m mRNA ^lJ W3 HAspergillus terreus、Aspergillus clavatus、Aspergillus fumigatus 禾口 Aspergillus niger 的木聚糖Bl序列進 亍同源比對， 找出兩段7個胺基酸的保守序列，再對該兩段胺基酸序列的mRNA進行同源比對，設計兩條正向簡併引物XynFl和XynF2 ；XynF1:5，-TACTA(C/T)TCCTTCTGGAC(C/T)GA-3，XynF2 5』 -GGCAACTTTGTCGG(C/T)GG(G/A)A-3 』以 A.oryzae CICC 40186 總 RNA 為模板，Oligo dT-Adaptor Primer 為引物反轉錄合成cDNA的第一條鏈；以M13 Primer M4和XynFl為引物進行第一輪PCR，其反應條件為 94°C 2min，30 個循環(94 °C 30s，53 °C 30s，72 °C 90s)，72 °C IOmin ；以 M13 Primer M4 和 XynFl為引物進行第二輪PCR，其反應條件為94°C 2min，30個循環(94°C 30s, 52°C 30s, 72 °C 90s), 72 °C IOmin ；目的條帶經克隆、測序，得到iVor xynllA 3'端mRNA序列；(2)AorxynllA 5'端mRNA序列的克隆基於上述得到的Aor xynllA 3'端mRNA序列，設計兩條反向引物XynRl和XynR2 ；XynRl TCCGGAGTAGGTGATTGCTCTXynR2 :CCATCCTTTCCCGCCGACGA以反轉錄合成的cDNA第一條鏈為模板、Outer I^rimer和XynRl為引物進行第一輪 PCR，其反應條件為94°C 3min，30 個循環(94 °C 30s, 55 °C 30s, 72 °C 60s), 72 °C IOmin ； 以Innerfrimer和XynR2為引物進行第二輪PCR，其反應條件為94°C 3min，30個循環 (94°C 30s，55°C 30s，72°C 60s)，72°C IOmin ；目的條帶經克隆、測序，得到 iVor xynllA 5' 端mRNA序列；
4.Aor XynllA工程菌的構建和表達方法(1)含編碼AorXynllA成熟肽基因的表達質粒的構建以M13 Primer M4和XynF3 為引物進行第一輪 PCR(94°C 2min ；30 個循環，94°C 30s, 53°C 30s, 72°C 60s ；72°C IOmin)； 以 XynF3 和 XynR3 為引物第二輪 PCR(94°C 2min ；30 個循環，94°C 30s, 53°C 30s, 72°C 45s ； 72°C IOmin)；將第二輪PCR的目的條帶進行克隆、測序；測序正確的pUCm-T-xynllA與 PPIC9K質粒均用EcoR I和Not I進行雙酶切，回收的酶切產物在T4DNA連接酶的作用下進行連接，得到重組質粒pPIC9K-XynllA，並對重組質粒進行測序鑑定；(2)GS115/xynllA的構建、表達、產物純化及活性測定用MlI對pPIC9K-xynllA進行線性化，按照畢赤酵母表達手冊進行電轉化、篩選，得到高拷貝的畢赤酵母重組子GS115/ xynllA ；該工程菌用1. 0%甲醇誘導96h，DNS法測得發酵液中重組殼聚糖酶活性達155U/ mL。發酵液經離心後的上清液為重組Aor XynllA粗酶液，經截留分子量為IOkDa的超濾膜濃縮，再經DEAE-kpharose Fast Flow離子交換層析和kphadex G_75凝膠過濾層析純化， 純化後經SDS-PAGE檢測為單一條帶，並顯示重組殼聚糖酶分子量為23kDa ；該重組殼聚糖酶最適作用溫度50°C，最適作用pH 5. 5，該酶在pH 4. 5 7. 5、40°C以下穩定。
全文摘要
本發明提出了一種源自米麴黴(Aspergillus oryzae)CICC 40186菌株的新型木聚糖酶基因序列的克隆方法，其核苷酸序列為SEQ ID NO1。生物信息學分析表明該木聚糖酶屬於糖苷水解酶第11家族，命名為Aor Xyn11A，其胺基酸序列為SEQ ID NO2，相應的基因命名為Aor xyn11A。本發明還公開了Aor Xyn11A工程菌的構建以及重組Aor Xyn11A的高效表達和純化的方法，製備的重組Aor Xyn11A的最適作用溫度和pH分別為50℃和5.5，在pH 4.5-7.5、40℃以下穩定，具有較大的工業化生產潛力和經濟價值。
文檔編號C12N15/81GK102392033SQ20111041041
公開日2012年3月28日 申請日期2011年12月12日 優先權日2011年12月12日
發明者史紅玲, 張慧敏, 李劍芳, 鄔敏辰, 高樹娟 申請人:江南大學