一種原位移植性小鼠肝癌模型及其製備方法和應用的製作方法
2023-09-17 01:47:25 3
專利名稱：一種原位移植性小鼠肝癌模型及其製備方法和應用的製作方法
技術領域：
本發明屬於生物醫藥技術領域，具體涉及一種以研究肝癌發展分子機制及抗 腫瘤藥物開發為目的的小鼠原位移植性肝癌模型及其製備方法和應用。
二.
背景技術：
原發性肝癌是我國常見惡性腫瘤之一，其死亡率高，在惡性腫瘤死亡順位中 居第三位。我國每年死於肝癌的人數約ll萬，佔全世界肝癌死亡人數的45%，肝 癌的治療亟待進步。理想的肝癌動物模型是抗腫瘤藥物開發、肝癌發生發展機制 及診斷治療研究必不可少的實驗工具。故成功地製作肝癌實驗動物模型，對於肝 癌相關實驗研究的開展起著至關重要的作用。
原位肝癌動物模型的建立方法大致分為四類，即自發性肝癌模型、誘發性肝 癌模型、移植性肝癌模型和轉基因動物肝癌模型，模型動物最常見為鼠。自發性 肝癌模型在發生學上與人類肝癌相似，但發生率低且不穩定，發生時間較難預測 且參差不齊，荷瘤動物在動物個體(性別、體重、腫瘤發生時間等)和腫瘤(大小、 數目、部位等)兩方面差異較大；誘發性肝癌模型最為常用，多採用化學藥物誘 發，但誘導周期長(3 5月，甚至l 2年)，操作煩瑣，死亡率高，肝癌出 現的時間、部位、病灶數等在個體之間表現不均一，而且這些化學藥物多易揮發， 有刺激性氣味，除致癌作用外還有化學毒性，會對實驗動物和實驗操作者自身造 成傷害；轉基因動物肝癌模型製作技術要求極高，價格昂貴，國內開展的尚較少。 原位移植性肝癌模型周期短、成功率高，是一種較好的動物腫瘤模型。目前移植 性肝癌模型根據植入物可分為瘤組織塊肝原位移植和細胞懸液肝原位移植。韓克 起等人用H22細胞株接種於ICR小鼠皮下形成實體瘤，再將瘤組織接種於小鼠肝 內形成肝原位移植瘤模型。在韓等的實驗中，製作程序繁瑣，成功率較低，且該 模型需先在小鼠皮下種植形成實體瘤，故每次實驗內移植的瘤組織塊不能來自於 同一鼠體，切割的組織塊大小不易一致，內容物不均一，且含有其他非癌組織， 這會嚴重影響實驗的重複性和可靠性，並不能完全真實反映抗肝癌藥物的作用效
果。李琦等和邵成偉等採用Walker-256細胞肝內注射建立了大鼠移植型肝癌模 型，模型採用的Walker-256細胞株在植入肝內後，雖能較好地模擬人肝癌的膨 脹性和浸潤性生長方式，但該細胞株來源於Wistar大鼠乳腺自發的癌肉瘤，而非 肝癌組織，故該模型不能很好的模擬肝癌的發生發展過程，更不能滿足抗肝癌藥 物研發篩選、肝癌分子生物學研究的需要。加之大鼠價格較貴且需要較大的飼養 空間，不易大批製作。現有的人-裸小鼠異種移植性肝癌模型雖有較高的移植成 功率，但裸小鼠免疫系統缺陷，不能反映正常生物體的真實情況，無法研究免疫 系統在肝癌發生中的作用以及對肝癌後續發展的影響，不能模擬藥物在機體中的 正常代謝。另外裸鼠-人肝癌移植模型技術條件要求高，裸鼠術後成活率低，且 無菌要求高、飼養困難、價格昂貴，因此這種模型的實用性受到了很大的限制。 同時，簡單的將瘤組織塊或細胞懸液移植入肝臟製成的肝癌模型均不足以充當研 究肝癌發生發展的分子機制及尋找抗肝癌藥物作用的分子靶點的平臺。故已存在 的各種肝癌動物模型都有一定的缺陷，無法滿足目前生物醫藥領域的需求。 三.
發明內容
本發明需要解決的問題是建立一種原位移植性小鼠肝癌模型，該模型能滿足 研究原發性肝癌發生發展及轉移的機制、同時也適用於抗腫瘤藥物開發、肝癌的 實驗性治療及診斷研究的需要。既能真實地模擬原發性肝癌的生物學特性，又簡 單、迅速、成功率高且價格低廉可以大批製作。
實現上述目的的技術解決方案如下
原位移植性小鼠肝癌模型的特徵為肝癌腫瘤結節內瘤細胞呈圓形或多邊 形，體積大，核大異形明顯，核分裂相易見；瘤細胞彌散分布或團塊狀、粗條索 狀；腫瘤間質量少，可見血管及出血現象；腫瘤無包膜，邊緣瘤細胞呈現浸潤性 生長，侵入正常肝臟組織內；在肺臟、腎上腺、腎臟脂肪囊、胰腺出現轉移灶； 腫瘤細胞內可轉入插入目的基因序列的質粒，可在小鼠肝臟的原位肝癌中過表達 或RNA幹擾目的蛋白。
原位移植性小鼠肝癌模型建立的方法為選用H22細胞株(購自南京凱基生 物科技發展有限公司)，該細胞株是BALB/c小鼠肝癌細胞株，既可在BALB/c小鼠 腹腔內培養製成H22腹水癌，又可在體外培養，保種傳代簡單方便；將質粒 pEGFP-Nl (美國Clontech公司)轉染進入H22細胞，並用G418篩選(南京大治生
物科技有限公司)形成穩定轉染的細胞株，注射入BALB/c小鼠(購自南京大學模 式動物研究所)腹腔擴增，待小鼠出現腹水後抽取腹水提取H22細胞，以G418 篩選後重新注射入小鼠腹腔內形成腹水癌，反覆3次，形成可適應體內環境的穩 轉細胞株；腹水癌小鼠的腹水內有大量EGFP標記的H22細胞，可供多次大量制 作動物模型，保證了動物模型的一致性，同時由於該細胞已經適應BALB/c小鼠 體內環境，同種移植，增加了細胞肝內移植的成功率；抽取腹水離心棄上清後加 入預冷的PBS溶液吹打衝洗1000rpm離心後棄上清，重複以上過程2-3次，再加入 預冷的PBS溶液吹勻後500rpm離心，紅細胞留於上清，棄上清保留沉澱細胞， 加入1640細胞培養基製成H22細胞懸液，以此步驟除去腹水中H22細胞以外的其 他成分，減少未知成分對模型動物的影響；將BALB/c小鼠以戊巴比妥鈉麻醉， 固定後於小鼠劍突下剪開皮膚和腹膜，使小鼠肝左葉暴露出切口，用微量注射器 抽取l X 107X5 u L細胞懸液注射入小鼠肝臟；微量注射器拔出後立即以75%酒精 棉籤按壓針孔至肝臟表面不再滲血，以此步驟殺死漏出的少量細胞，並可避免細 胞懸液漏出肝臟；用粘合劑封閉針孔，以防止H22細胞滲出流入腹腔後造成的腹 腔內廣泛轉移灶而導致腫瘤種植失敗；以生理鹽水衝洗肝臟表面，既能防止穿刺 孔漏出的H22細胞進入腹腔導致模型失敗，又能溼潤暴露的肝臟減少對小鼠的損 傷，提高術後存活率。
本發明的有益效果是，用此方法建立的肝癌模型具有以下特點(l)腫瘤位於 肝臟，且以單發性為主；腫瘤生長與血供特徵與人類原發性肝癌相似；出現血道 轉移(肝內及肺轉移)和淋巴道轉移；(2)腫瘤結節為肝癌組織，生物學特性穩 定而均一，其病理形態與人的肝癌結節相似；(3)腫瘤形成周期短、腫瘤生長快、 病程發展快、患體生存期短，腫瘤可控性好且生長環境符合真實機體情況；(4) 腫瘤細胞用綠色螢光蛋白(EGFP)標記，可以隨時活體監測腫瘤的生長以及轉 移狀況；(5)可以在轉入腫瘤細胞的EGFP-N1質粒內插入目的基因序列，過表達或 RNA幹擾目的蛋白，研究該蛋白在肝癌發展及轉移過程中的作用；(6)經過體外-體內篩選的腫瘤細胞在動物體內生長過程中質粒不容易丟失，可更準確地檢測腫 瘤生長過程中分子的表達，以便研究該分子在肝癌發生發展過程中的功能；(7) 操作安全簡單，操作所致死亡率低，動物模型穩定性、重複性好、成功率高；(8)
可大批製作且同步性好，適用於藥物篩選及較大規模的實驗性治療。故該模型是
一種可以用於研究原發性肝癌發展及轉移機制、同時也適用於抗腫瘤藥物開發、
肝癌的實驗性治療及診斷研究的理想的原發性肝癌模型。
四.
下面結合附圖和實施例對本發明結果進一步說明。
圖l是模型小鼠腹腔近照，結節大小約為1.3cmXl.km，腫瘤境界不清，附 近有附生的小結節。
圖2是模型小鼠肝左葉腫瘤結節近照(正面)。 圖3是模型小鼠肝左葉腫瘤結節近照(背面)。
圖4是肝癌腫瘤的病理照片，細胞形態多樣，異型性明顯(HE染色，100X)。 圖5是肝癌細胞侵入腎周圍脂肪囊(HE染色，200X)。 圖6是肝癌的肺多發性早期轉移灶(HE染色，200X)。 圖7是肝癌細胞侵入腎周的EGFP免疫組化陽性細胞分布(400X )。 圖8是肝癌的肺多發性早期轉移灶的EGFP免疫組化陽性細胞分布(400X )。 圖9是肝癌細胞侵入門管區的EGFP免疫組化陽性細胞分布(400X )。 圖10是用螢光顯微鏡觀察的體內穩定轉染EGFP的H22細胞的照片(200X )。 五.
具體實施例方式
下面通過實施例對本發明做進一步說明。
將質粒EGFP-N1轉染進入H22細胞，並用G418篩選形成穩定轉染的細胞株，注 射入BALB/c小鼠腹腔擴增，待小鼠出現腹水後，抽取腹水提取H22細胞，以G418 篩選後重新注射入小鼠腹腔形成腹水癌，反覆上述過程3次，形成的腹水癌小鼠 的腹水內有大量適應體內環境且穩定轉染EGFP的H22細胞株。用注射器從腹水 癌小鼠的腹腔內抽取腹水2mL，置於離心管內，1000rpm離心，棄上清。加入5mL 預冷的PBS液重懸、吹洗，再1000rpm離心5分鐘，棄上清。用預冷的PBS溶液以 同樣方法重複洗一遍。在沉澱內加入5mL預冷的PBS溶液吹散細胞，500rpm離心 5分鐘，保留下層白色細胞沉澱。用lmL培養基重懸細胞，計數，再加入適量培 養基稀釋成l X 1(^個/mL的細胞懸液備用。將BALB/c小鼠以50mg/kg腹腔注射戊 巴比妥鈉麻醉後固定。在上腹部備皮，再以碘伏消毒、75%酒精脫碘。在小鼠上 腹部開口，在腹膜上沿腹白線切開，使小鼠肝左葉暴露出腹腔，用微量注射器抽 取5u L細胞懸液以30度注射入肝葉，出針後立即用75%酒精棉籤按壓至肝臟表面 無滲血後，用少量粘合劑塗抹於針孔，待幹後用生理鹽水衝洗暴露的肝葉。將肝葉輕輕送回腹腔，縫合切口。以75%酒精擦拭切口後，塗抹一層金黴素眼藥膏。 待小鼠甦醒後送回動物房，保證食水供應。三周後將小鼠斷頸處死，切開皮膚腹 膜，可見在小鼠肝臟和脾臟明顯腫大，肝左葉注射部位有明顯的單發白色結節。 取肝和肺在福馬林溶液中固定保存後做病理切片檢查。經東南大學基礎醫學院 病理教研室病理檢查結論為瘤細胞呈圓形或多邊形，體積大，胞漿豐富，核大 異形明顯，核分裂相易見。瘤細胞彌散分布或團塊狀、粗條索狀。腫瘤間質量少， 可見血管及出血現象。腫瘤無包膜，邊緣瘤細胞呈現浸潤性生長，侵入正常肝臟 組織內，有的腫瘤邊緣可見增生的膽管，膽管上皮細胞輕度異形。多數腫瘤出現 大片凝固性壞死，即腫瘤細胞死亡，但細胞輪廓仍在。腫瘤組織內無明顯炎細胞 浸潤，少數腫瘤邊緣與正常肝組織交界處有少量單核細胞及中性粒細胞浸潤。在 肺臟、腎上腺、腎臟脂肪囊、胰腺發現轉移灶。此方法建立的模型小鼠肝癌發生 率為100%，自然消退率為零，可以模擬出人類肝癌病程中常見的臨床症狀，如 原發性肝癌的消痩、水腫、肝脾腫大、腹水、黃疸、癌灶轉移、消化道出血、肝 癌腫塊破裂出血等。以此方法建立的原發性肝癌小鼠模型的效果大大優於目前已 有的原發性肝癌動物模型，可用於具有更加真實性和實用性。
權利要求
1.一種原位移植性小鼠肝癌模型，其特徵是肝癌腫瘤結節內瘤細胞呈圓形或多邊形，體積大，核大異形明顯，核分裂相易見；瘤細胞彌散分布或團塊狀、粗條索狀；腫瘤間質量少，可見血管及出血現象；腫瘤無包膜，邊緣瘤細胞呈現浸潤性生長，侵入正常肝臟組織內；在肺臟、腎上腺、腎臟脂肪囊、胰腺出現轉移灶；腫瘤細胞內轉入插入目的基因序列的質粒，過表達或RNA幹擾目的蛋白，研究該蛋白在腫瘤發展及轉移過程中的作用。
2. 根據權利要求l所述原位移植性小鼠肝癌模型的建立方法，其特徵在於-選用H22細胞株，選用的BALB/c小鼠是我國常用的實驗動物品系，將H22細胞制 成穩定轉染EGFP的H22細胞株，並將穩定轉染EGFP的H22細胞保種培養在 BALB/c小鼠腹腔中，抽取腹水，分離細胞並製成細胞懸液，用微量注射器抽取 細胞懸液注射入小鼠肝臟，用75%酒精棉籤按壓針孔至肝臟表面不再滲血，用粘 合劑封閉針孔，以生理鹽水衝洗肝臟表面。
3. 根據權利要求2所述原位移植性小鼠肝癌模型的建立方法，其特徵在於體 內穩定轉染EGFP的H22細胞株的製備方法將質粒EGFP-N1轉染進入H22細胞， 並用G418篩選形成穩定轉染的細胞株，注射入BALB/c小鼠腹腔擴增，待小鼠出 現腹水後，抽取腹水提取H22細胞，以G418篩選後重新注射入小鼠腹腔待腹水癌 生成，重複3次後，形成的腹水癌小鼠的腹水內有穩定轉染EGFP細胞株。
4. 根據權利要求2所述原位移植性小鼠肝癌模型的建立方法，其特徵在於細 胞懸液的製備方法抽取腹水，1000rpm離心5分鐘，棄上清，加入預冷的PBS 溶液吹打洗滌沉澱，1000rpm離心5分鐘後棄上清，重複洗漆過程2-3次，再加入 預冷的PBS溶液吹勻後500rpm離心5分鐘，紅細胞留於上清，棄上清保留沉澱細 胞，加入細胞培養基製成H22細胞懸液。
5. 根據權利要求2所述原位移植性小鼠肝癌模型的建立方法，其特徵在於 BALB/c小鼠以戊巴比妥鈉麻醉，固定後於小鼠上腹部分層剪開皮膚和腹膜，將 小鼠肝左葉按壓出切口 ，用微量注射器抽取l X 107X 5 P L穩定轉染EGFP的H22 細胞懸液注射入小鼠肝臟。
6. 根據權利要求1所述的原位移植性小鼠肝癌模型在研究肝癌發生發展機 制中的應用。
7.根據權利要求1所述的原位移植性小鼠肝癌模型在抗腫瘤藥物開發及肝 癌實驗治療和診斷中的應用。
全文摘要
本發明屬於生物醫藥技術領域，具體涉及一種以研究肝癌發生發展機制及抗腫瘤藥物開發為目的的原位移植性小鼠肝癌模型及其製備方法和應用。將穩定轉染EGFP的H22細胞株注射入BALB/c小鼠腹腔擴增，從H22腹水癌小鼠腹腔內抽取腹水，分離細胞並製成細胞懸液，打開小鼠腹腔，用微量注射器抽取細胞懸液注射入小鼠肝臟，用75％酒精棉籤按壓針孔至肝臟表面不再滲血，用粘合劑封閉針孔，再以生理鹽水衝洗肝臟表面，分層關腹。結果顯示模型小鼠肝癌發生率為100％，自然消退率為零。該模型是一種可以用於研究原發性肝癌發展及轉移的機制、同時也適用於抗腫瘤藥物開發、肝癌的實驗性治療及診斷研究的理想的原發性肝癌模型。
文檔編號A61K49/00GK101185764SQ20071013332
公開日2008年5月28日 申請日期2007年10月17日 優先權日2007年10月17日
發明者煜 張, 徐涵文, 沈萍萍 申請人:南京大學