一種具有高黏附力的植物乳桿菌的製作方法
2023-08-22 13:31:56 1
本發明屬於微生物領域，涉及一種具有高黏附力的植物乳桿菌。
背景技術：
：益生菌是一類對人體有益的微生物的總稱，包括乳酸菌、雙歧桿菌、嗜酸乳桿菌、放線菌、酵母菌等。其中，乳酸菌是指發酵糖類並且主要產物為乳酸的一類革蘭氏陽性菌的總稱，廣泛分布在動物體的腸道中，具有維持腸道菌群平衡、增強免疫力、促進營養物質利用等功效。由於乳酸菌具有上述有益健康的作用，多個國家和組織將含有乳酸菌的食品視為健康食品或保健食品加以推廣，例如，日本衛生部就將含有乳桿菌、雙歧桿菌等的食品定義為有特殊健康意義用途的食品。目前，研究界普遍認為乳酸菌在維持腸道菌群平衡方面的作用是通過抑制有害菌生長來實現的。有研究表明，乳酸菌能夠利用自身與腸道內壁黏液或上皮細胞的黏附作用來定植在腸道內壁上，從而佔據黏附位點，並且通過空間位阻作用阻止有害菌在腸道內壁上的黏附和生長。因此，乳酸菌的黏附力高低是評價乳酸菌的對腸道的有益作用的重要指標，其黏附力越高，則越容易在腸道內壁上定植，發揮更好的保健作用。技術實現要素：為了提供一種具有高黏附力的乳酸菌，本發明通過菌種分離和篩選，得到了一種具有高黏附力的植物乳桿菌AR326，其特徵在於，該植物乳桿菌菌株AR326在中國普通微生物菌種保藏管理中心進行保藏，其保藏編號為CGMCCNo.12469。進一步地，本發明還提供了上述植物乳桿菌菌株在發酵製備活性乳酸菌產品中的應用。發明作用與效果根據本發明提供的植物乳桿菌菌株，由於具有高黏附力，能夠在腸道中很好地定植，抑制腸道有害菌的生長，因此具有的腸道菌群調節作用，有利於機體健康。具體實施方式以下結合實施例來說明本發明的具體實施方式。下述實施例中所使用的HT-29細胞為人結腸癌細胞，由江南大學饋贈；泡菜及黃酒酒糟從市售食品中取樣；其他試劑從普通商業途徑獲得，未提及的實驗條件均參照常規實驗條件或供應商建議。首先，從泡菜及黃酒酒糟中採樣，經過富集、初篩，得到了19株乳酸菌。然後，對上述19株乳酸菌進行篩選，具體步驟如下：步驟1，製備HT-29細胞爬片。在12孔板的每個孔中都放入無菌的空白細胞爬片，加入2ml1640完全培養基，在每個孔中加入0.5ml濃度為1×106個/ml的HT-29細胞懸液，過夜培養，得到含有80％～90％細胞的HT-29細胞爬片。其中，1640完全培養基的配方為1640培養基:胎牛血清＝9:1。步驟2，製備19株菌株的菌懸液，每種菌株的菌懸液製備步驟如下：將菌接種到MRS培養基中製備種子液，再按1％(體積比)的接種量將種子液接種入100mlMRS培養基。37℃培養12小時後，在3000G條件下離心10分鐘，棄去上清並用PBS緩衝液洗兩次，再用PBS緩衝液將菌體沉澱懸浮，加入適量PBS緩衝液調節菌體濃度，直到菌懸液吸光度為0.6。此時，菌體濃度約為109cfu/ml。其中，MRS培養基的製作方法為：取酪蛋白腖10g、牛肉浸出粉10g、酵母浸粉5g、葡萄糖20g、CH3COONa·3H2O8.3g、檸檬酸氫二胺2g、MnSO4·H2O0.25g、K2HSO42g、MgSO4·7H2O0.58g、吐溫-801mL、1000mL去離子水，混合溶解後115℃滅菌20min。PBS緩衝液的製作方法為：取NaCl8g、KCl0.2g、Na2HPO41.56g、KH2PO40.2g，去離子水溶解後定容至1000ml，調PH至7.4，115℃滅菌20min。步驟3，將步驟2製備得到的19種菌株的菌懸液各取1ml，分別加入步驟1得到的12孔板的孔中，再向每個孔中加入1ml1640完全培養基，放入細胞培養箱培養2小時。PBS緩衝液洗兩次後，加入適量無水甲醇固定20分鐘，用革蘭氏染色法進行染色，取出細胞爬片，1000倍顯微鏡下隨機選擇20個視野進行拍照，結果如表1所示。表1不同菌株的黏附性能菌株名稱每百個細胞平均黏附數菌株名稱每百個細胞平均黏附數AR150160AR269411AR187254AR303136AR277205AR289151AR237234AR132372AR287218AR179267AR319384AR371322AR340366AR387390AR345206AR333298AR326430AR226291AR195253由表1可知，在每100個細胞上黏附有430個AR326菌，AR326菌株的黏附數量明顯高於其他菌株，說明在上述19個菌株中，AR326菌株具有最高的黏附力。通過利用通用引物27F和1492R擴增AR326菌株的16SrDNA序列，測序後經blast比對，發現與植物乳桿菌有99％的相似性，可以確認該菌株AR326為植物乳桿菌(LactobacillusplantarumAR326)。另外，該菌株AR326已經於2016年5月20日在中國普通微生物菌種保藏管理中心(地址為北京市朝陽區北辰西路1號院3號)進行保藏，其保藏編號為CGMCCNo.12469。實施例作用與效果根據本發明提供的植物乳桿菌菌株AR326，由於具有高黏附力，其黏附力達到了每100個細胞可黏附430個菌，因此該菌株AR326能夠在腸道中很好地定植，抑制腸道有害菌的生長，具有良好的腸道菌群調節作用，有利於機體健康。此外，本發明提供的植物乳桿菌菌株從泡菜和黃酒酒糟中篩選獲得，其來源均為食物，因此具有高安全性，能夠應用在食品發酵當中，其活菌也能夠直接食用而對人體不產生有害效果。當前第1頁1 2 3